Бульон Microdilution в пробирке скрининга: легкий и быстрый метод для обнаружения новых противогрибковых соединений

Общая цель данного метода заключается в оценке активности потенциальных противогрибковых соединений с использованием модификации теста чувствительности к микроразведению бульона, используемого в клинических лабораториях. Этот метод используется для оценки грибковой активности природных или синтетических соединений, что является одним из первых тестов в разработке противогрибковой терапии. Мы предоставляем инструкции по первоначальному скринингу новых противогрибковых препаратов с использованием небольших объемов в короткие сроки, особенно если эксперименты проводятся с автоматизацией.

Демонстрировать процедуру будет Даниэль Замит-Миранда, постдокторант в моей лаборатории. Начните эту процедуру с выращивания штаммов грибов для анализа, как описано в текстовом протоколе. На следующий день соберите клетки, центрифугируя конические пробирки при температуре 1200 G в течение пяти минут при комнатной температуре.

Выбросьте надосадочную жидкость, добавьте десять миллилитров PBS в каждую трубку и снова суспендируйте клетки. Снова центрифугируйте при 1200 G в течение пяти минут при комнатной температуре. Повторите промывку PBS и центрифугирование еще два раза.

После третьей промывки ресуспендируйте клетки в пяти миллилитрах среды двойной концентрации RPMI 1640. В зависимости от мутности клеточной суспензии приготовьте один миллилитр одного к 100 или один к 1000 разведения каждого штамма в микроцентрифужной пробирке. Наберите десять микролитров этого раствора, поместите его в камеру гемоцитометра и подсчитайте общее количество клеток в четырех угловых квадрантах под микроскопом.

После расчета плотности каждой суспензии ячеек готовят суспензии стоковых ячеек в среде RPMI 1640 двойной концентрации. Подготовьте 4 000 клеток на миллилитр для штаммов C.albicans и 20 000 клеток на миллилитр для штаммов C.neoformans. Лифолизированные пептиды хранятся в аликватах для однократного использования при температуре минус 20 градусов Цельсия и растворяются только в деионизированной воде перед каждым экспериментом.

Концентрация пептида должна быть в два раза выше самой высокой конечной концентрации, испытанной в анализе. Также готовятся референсные противогрибковые препараты. Противогрибковый анализ проводится в микропланшетах из полистирола в тройном размере и 96 лунках.

Используется двукратное серийное разведение каждого пептида и контрольного противогрибкового средства, а конечный объем составляет 50 микролитров на лунку. Самым важным этапом в протоколе является серийное разведение, поэтому будьте очень осторожны в течение следующих нескольких шагов, чтобы избежать ошибок, которые могут поставить под угрозу весь ваш анализ. С помощью пипетки добавьте 100 микролитров противогрибкового пептида в двойную концентрацию наивысшей желаемой конечной концентрации в столбцы с первого по третий в ряду А. С помощью многоканальной пипетки добавьте 50 микролитров стерильной воды в другие лунки в рядах от В до Н. Удалите 50 микролитров из лунок с самой высокой концентрацией.

Переложите в соответствующие лунки следующей концентрации, и гомогенизируйте путем пипетирования вверх и вниз несколько раз. Повторяйте серийное разбавление до тех пор, пока не будут достигнуты лунки с самой низкой концентрацией, и выбросьте из этих лунок 50 микролитров. Оставьте в столбцах 11 и 12 строк A, B и C только воду для пустых элементов контроля или отрицательного контроля роста.

Добавьте 50 микролитров скорректированного по двойной концентрации инокулята в среде RPMI 1640 в каждую лунку колонн с первой по третью, плюс колонку 11. Конечная концентрация для C.albicans составит 2000 клеток на миллилитр. Конечная концентрация для C.neoformans составит 10 000 клеток на миллилитр.

Приготовьте средства для контроля отрицательного роста, смешав 50 микролитров воды и 50 микролитров скорректированного посевного материала без противогрибкового средства. Приготовьте заготовки контрольных блоков, соединив 50 микролитров воды и 50 микролитров среды без ячеек. Загрузите элементы управления в соответствующие лунки.

Наблюдайте за всеми лунками с помощью инвертированного оптического микроскопа, а затем инкубируйте планшеты при 37 градусах с встряхиванием при 200 оборотах в минуту. После инкубационного периода снова осмотрите все лунки, чтобы убедиться в изменениях морфологии, а также проверить наличие признаков загрязнения. Получите изображение каждой пластины с помощью цифровой камеры.

В этом репрезентативном анализе три антимикробных пептида, или АМП, с концентрациями от 100 микромолей до восьми микромоляров, были оценены на предмет противогрибковой активности в отношении C.neoformans. В комплект входили регулятор роста и заготовка. Любая скважина с прозрачной средой, подобная глухой скважине, считается положительным результатом, в то время как любая скважина с мутностью, аналогичной отрицательной контрольной скважине, считается отрицательной.

Поскольку минимальная ингибирующая концентрация, или MIC, определяется как самая низкая концентрация антимикробного соединения, которая полностью подавляет видимый рост грибка в конце инкубационного периода, 25 микромоляров считается MIC для AMP1. И 12 целых пять микромоляров, MIC для AMP2. AMP3 придется переоценивать, так как грибок рос во всех протестированных концентрациях.

Таким же образом, три различных пептида, протестированных против C.albicans, с указанием 50 микромоляров являются МПК для АМФ1. Шесть микромоляров — это MIC для AMP2, а 25 микромоляров — это MIC для AMP3. Пример плохого результата, вероятно, из-за неправильного пипетирования на этапе разведения, проиллюстрирован столбцами с пятого по седьмой ряда C на этой пластине, где присутствуют различия в росте C.neoformans между репликами.

После освоения этой техники ее можно выполнить примерно за два часа, плюс время роста грибка, если она выполнена правильно. Не забывайте знать о физико-химических особенностях этих тестируемых молекул. Затем используйте соответствующие растворители в качестве контроля, если они необходимы, и всегда используйте клетки в одной и той же фазе роста.

После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как анализ на время убийства, использование красителей на жизнеспособность и анализ ST60, чтобы ответить на дополнительные вопросы, например, обладает ли соединение фунгицидным или фунгистатическим эффектом. После своего развития этот метод проложил путь исследователям в области медицинской микрологии к изучению нескольких источников природных или синтетических соединений в поисках противогрибковых соединений. После просмотра этого видео вы должны иметь хорошее представление о том, как начать культивирование грибов, подготовить клетки к анализу, выполнить серийные разведения и прочитать результаты после инкубации штаммов грибов с нашими протестированными соединениями.

Не забывайте, что работа с грибковыми патогенами может быть чрезвычайно опасной. При выполнении этой процедуры следует соблюдать такую подготовку, как ношение средств индивидуальной защиты, работа в капюшоне биологической безопасности и использование соответствующих мер безопасности.