Microfluidic чипы для In Situ кристалл рентгеновской дифракции и на месте Динамическое рассеяние света для последовательного кристаллографии

Общая цель этой процедуры заключается в изготовлении и эксплуатации микрофлюидного устройства для сбора данных рентгеновской дифракции кристаллизации белка при комнатной температуре. Основное преимущество этой методики заключается в том, что кристаллизация внутри чипа сводит к минимуму механическое возмущение кристаллов белка. Эти рентгеновские прозрачные чипы просты в изготовлении, могут быть установлены непосредственно на гониометрах большинства синхротронных пучков и эффективно использовать доступные кристаллы при сборе рентгеновских дифракционных данных.

Сначала поместите мастер-форму конструкции рентгеновского чипа в 10-сантиметровую чашку Петри, облицованной алюминиевой фольгой. Смешайте около 30 граммов основы PDMS и отвердителя в соотношении 10 к одному и вылейте PDMS на мастер на высоту четырех миллиметров. Дегазируйте PDMS в вакуумном эксикаторе в течение пяти минут и продуйте воздух, чтобы удалить оставшиеся пузырьки воздуха на поверхности PDMS.

Высушите PDMS в духовке при температуре 70 градусов Цельсия в течение одного часа. Затем аккуратно снимите отвержденную форму PDMS с мастера. С помощью скальпеля отрежьте излишки PDMS.

Перед изготовлением рентгеновских чипов убедитесь, что рабочее пространство организовано таким образом, чтобы обеспечить легкий доступ ко всему необходимому оборудованию и компонентам во время литья в эпоксидную форму. Чтобы начать изготовление микросхемы, разбавьте прекурсоры двухкомпонентной эпоксидной смолы этанолом с этанолом до конечной массовой концентрации этанола 40% по весу. С помощью вихревого миксера смешайте эпоксидную смолу и этанол.

Дегазируйте форму PDMS в вакуумном эксикаторе в течение 30 минут, чтобы гарантировать, что PDMS позже сможет поглощать мелкие пузырьки воздуха из эпоксидной смолы. Отрежьте кусок полиимидной фольги толщиной 7,5 на 70 мм и оберните фольгу вокруг предметного стекла размером 75 на 50 миллиметров. Прикрепите края фольги к тыльной стороне предметного стекла, чтобы сформировать плоскую жесткую полиимидную поверхность.

Обработайте полиимидную фольгу с затворной подложкой кислородной плазмой в течение 20 секунд. Затем инкубируйте фольгу в водном растворе APTS или GPTS объемом 1% по объему в течение пяти минут при температуре 20 градусов Цельсия. Во время силанизации тщательно перемешайте растворы предшественников эпоксидной смолы с помощью небольшого шпателя.

Перенесите дегазированную форму PDMS из вакуумного эксикатора на плоскую поверхность. Высушите силанизированную полиимидную фольгу сжатым воздухом или газообразным азотом. Быстро нанесите каплю смоляной смеси на каждую микроструктуру на форме.

Положите полиимидную фольгу с затвором на эпоксидную смолу лицевой стороной вниз и сильно надавите на предметное стекло. Накройте сборку полиэтиленовой пленкой и металлическим листом. Поместите грузы на металлический лист, чтобы приложить к сборке давление до 1,4 ньютона на квадратный сантиметр.

Через 15 минут аккуратно отделите предметное стекло от полиимидной фольги с эпоксидным рисунком и протрите полиимидную фольгу до полного высыхания. Положите сверху пластиковую фольгу, металлический лист и грузы. Дайте эпоксидной смоле застыть при комнатной температуре в течение одного часа.

После этого снимите грузы, металлический лист и пластиковую пленку. Аккуратно отклейте полиимидную фольгу с рисунком от формы PDMS. Плазма обрабатывает узорчатую фольгу в течение 20 секунд и силанизирует узорчатую фольгу с помощью APTS или GPTS, как описано ранее.

Силанизируйте нетронутую полиимидную фольгу с другим раствором силана в тех же условиях. Высушите обе пленки сжатым воздухом. Затем нанесите каплю деионизированной воды на чистую, сухую ровную поверхность.

Вырежьте отдельные структуры стружки на полиимидной фольге и поместите узорчатую полиимидную фольгу эпоксидной стороной вверх на каплю воды и тщательно разгладьте фольгу до полного выравнивания. Положите вторую полиимидную фольгу на узорчатую фольгу силанизированной лицевой стороной вниз. Аккуратно разгладьте вторую фольгу вручную от угла к противоположному, чтобы удалить пузырьки воздуха и склеить полиимидные листы вместе.

Чтобы начать изготовление портов доступа, вырежьте из отвержденной четырехмиллиметровой плиты PDMS блок достаточного размера, чтобы покрыть все порты в полиимидном рентгеновском чипе, не закрывая отсек кристаллизации. Плазменная обработка, силанизация и сушка полиимидного чипа и блока PDMS. Прижмите обработанный блок к чипу над портами.

Накройте скол пластиковой пленкой, чистым предметным стеклом и металлическим листом. Надавите по 1,4 ньютона на квадратный сантиметр в течение одного часа. Затем используйте 0,75-миллиметровый биопсийный перфоратор, чтобы пробить входные и выходные отверстия, отмеченные в конструкции чипа.

Заклейте заднюю часть чипа полиимидной пленочной электроизоляционной лентой. Затем разбавьте массовый раствор прозрачного фторполимерного материала покрытия 9% по весу до 0,45% по весу с помощью фторированного растворителя. Подсоедините к шприцу иглу 27-го калибра размером 5/8 дюйма.

Наденьте политетрафторэтиленовую трубку на конец иглы. Загрузите раствор фторполимера в одномиллилитровый шприц с замком Люэра. Подсоедините другой конец трубки к выходу рентгеновского чипа.

Введите раствор фторполимера в чип до тех пор, пока все каналы не будут заполнены, и удалите излишки раствора фторполимера с помощью шприца, наполненного воздухом. Поместите наполненную фишку плоской стороной вниз на горячую плиту при температуре 190 градусов Цельсия. Нагрейте чип в течение пяти минут, чтобы испарить растворитель, тем самым покрыв каналы фторполимером.

Перед процедурой кристаллизации отфильтруйте выбранный белковый раствор с помощью фильтра толщиной 0,2 микрона. Центрифугируйте раствор в течение 15 минут при 16, 100 g и 20 градусах Цельсия и восстановите надосадочную жидкость для экспериментов по кристаллизации. Чтобы начать процедуру кристаллизации, соедините равные объемы белкового раствора и его осадителя.

Наберите в шприц около 20 микролитров этой смеси. С помощью иглы 27 калибра 5/8 дюйма и трубки из ПТФЭ подсоедините шприц к входу рентгеновского чипа. Таким же образом подсоедините к выходному отверстию шприц с фторированным маслом.

Во время наблюдения за чипом под микроскопом заполняйте кристаллизационный раствор через входное отверстие в чип с параллельной компоновкой. Введите достаточное количество фторсодержащего масла, чтобы отделить отсеки кристаллизации в чипе. Затем заблокируйте входной и выпускной порты скрепками или другими узкими заглушками.

Храните чип в соответствующих условиях кристаллизации. Образование кристаллов теперь можно наблюдать под микроскопом или с помощью динамических измерений рассеяния света. Когда все будет готово к сбору данных, используйте двусторонний скотч, чтобы зафиксировать рентгеновский чип на напечатанном на 3D-принтере адаптере для пластинчатого угломера.

Установите адаптер микросхемы на пластинчатый угломер на синхротронном луче. Сбор и анализ дифракционных данных. Для количественной оценки скорости испарения воды из кристаллизационных камер чипа из полиимидной фольги использовалась светлопольная микроскопия.

Динамическое рассеяние света позволило обнаружить начальное зарождение кристаллов тауматина в чипе PDMS на предметном стекле с эквивалентной геометрией, что позволило оптимизировать условия кристаллизации. Было собрано 10 дифракционных картин от каждого из 83 кристаллов тауматина, выращенных в полиимидном чипе с вращением на один градус в течение каждого кадра. Набор данных был разделен на пять поднаборов данных по кадрам, а затем был оценен затухание интенсивности нормализованной дифракционной мощности с течением времени.

К четвертому набору данных дифракционная мощность снизилась до уровня ниже 50%.Значения R-фактора измерений поднаборов данных со временем увеличивались, что указывает на то, что кристаллы подверглись радиационному повреждению во время сбора данных. Это было связано со свободными радикалами, образующимися при рентгеновском облучении, разрушающими соседние кристаллы в том же отсеке. Бипирамидальные кристаллы тауматина имели широкое распределение ориентаций в рентгеновском чипе.

Орторомбические кристаллы глюкозоизомеразы также показали широкое распределение ориентаций при выращивании в полиимидном чипе. Тем не менее, кристаллы тиоредоксина преимущественно имели ориентацию в плоскостях xy, xz и yz, возможно, из-за их удлиненной формы. В целом, эти чипы очень прочные и имеют низкий рентгеновский фон.

Это делает данный метод изготовления подходящим для других методов рентгеновской визуализации, таких как малоугловое рассеяние рентгеновского излучения. Эта процедура может быть легко адаптирована к вашим экспериментальным потребностям. Например, конструкцию микросхемы можно изменить, отрегулировав размеры отдельных отсеков или общее количество отсеков на микросхеме.

Мы уделяли особое внимание разработке рабочего процесса, который не требовал бы дорогостоящего оборудования, такого как специализированные инструменты или микрофлюидные насосы. После просмотра этого видео и прочтения рукописи у вас должно быть хорошее понимание того, как кристаллизоваться в чипе, контролировать процесс кристаллизации, а также записывать и анализировать дифракционные данные с использованием чипового подхода. После освоения эта технология позволяет серийно изготавливать микрофлюидные чипы на мастер-сервере PDMS примерно за три часа без необходимости использования специального чистого помещения.