Измерение Endoreduplication подачей Cytometry изолированных клубней протопласта

Общая цель этого эксперимента — оценить уровни эндоредупликации в клубнях картофеля. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы о морфологии клубней картофеля, такие как стадия развития, на которой ткани клубней подвергаются эндоредупликации. Основное преимущество этой методики заключается в том, что она дает гораздо более четкие результаты по сравнению с обычными препаратами проточной цитометрии.

Демонстрировать процедуру будет компания Parker Laimbeer. Аспирант из моей лаборатории. После приготовления растворов и буферов в соответствии с текстовым протоколом поверхность простерилизовать клубни картофеля, погрузив их в 71%-ный этанол не менее чем на пять минут.

Удалите растительные материалы из этанола и дайте им высохнуть на воздухе. Приготовьте и промаркируйте стерильные 50 миллилитровые конические пробирки для каждого образца и добавьте в каждую 15 миллилитров фильтрованного стерилизованного раствора для плазмолиза или PIS. С помощью либо стерилизованного скальпеля, либо пробки пробурить примерно один кубический сантиметр желания стерилизовать ткани.

С помощью стерилизуемого скальпеля крупно нарежьте ткань примерно на три кубических миллиметра. И перенесите ткань в коническую трубку, содержащую PIS. Затем инкубируйте ткань при температуре четыре градуса Цельсия в течение ночи.

Для получения картофельных протопластов начинают с приготовления и фильтрации соответствующего количества раствора фермента или ЭС с 0,71 молярного маннитола, трех миллимолярных хлоридов кальция, одного миллимолярного монокалийфосфата. Один миллимолярный хлорид магния, 4% целлюлазы Onozuka R-10, 0,8% мацероцима R-10, 1% гемицеллюлазы и 10 миллимолярный буфер MES, pH 5,8. С помощью серологической пипетки отсасывайте PIS из образцов в пробирках.

Добавьте по 10 миллилитров ЭС в каждый образец и переверните пробирки два-три раза. Затем инкубируйте образцы при температуре 29% Цельсия и 180 об/мин в течение ночи. На третий день, чтобы собрать и промыть протопласты, извлеките образцы из шейкера и дайте им отстояться примерно на 10 минут.

С помощью серологической пипетки отсасывайте как можно больше раствора ES, стараясь не допустить переваривания тканей. Затем с помощью микропипетки, удерживая трубку под углом, снова удалите остатки раствора ES, избегая переваренной ткани. Крайне важно удалить как можно больше раствора протопласта, чтобы избежать повреждения ядер.

Держание трубки под углом может помочь с выводом раствора при выходе из протопластов. Добавьте 15 миллилитров PWS в каждый образец. И аккуратно переверните трубку два-три раза.

Дайте протопластам отстояться в течение 10 минут. Затем с помощью серологической пипетки удалите PWS. И микропипетка для удаления остатков жидкости.

Держа образцы на льду, добавьте в каждую пробирку по 1,5 миллилитра ледяного FCB. Кратковременно встряхните или встряхните каждый образец, чтобы разбить агрегированную ткань. Важно разбить комки ткани клубней, чтобы ПКБ мог полностью проникнуть в клетки и высвободить ядра.

Если необходимо добавить контроль, начиная с этого шага, используйте лезвие бритвы, чтобы мелко нарезать небольшой лист в 1,5 миллилитрах ледяного FCB. Контрольные образцы должны быть такой же плотности, как и экспериментальные образцы, желательно того же генотипа. Вставьте микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитра с отрезанным кончиком и металлической сеткой толщиной 106 микрометров, расплавленной до дна, в двухмиллилитровую микроцентрифужную пробирку.

Затем пропустите через фильтр один миллилитр тканевой суспензии ПКБ. Добавьте 250 микролитров раствора РНК в каждый образец. Затем переверните трубки и выдержите их в течение 30 минут при комнатной температуре.

Добавьте в каждый образец по 125 микролитров предварительно приготовленного йодида пропидия или раствора ПИ. Переверните и инкубируйте трубки на льду в течение 30 минут. Используйте образцы как можно скорее и в течение двух часов избежите деградации.

Создайте две точечные диаграммы, используя логарифмическую шкалу прямого рассеяния в зависимости от бокового рассеивания и PI в зависимости от бокового рассеивания. Также создайте гистограмму с PI по оси x. Логарифмическая шкала необходима, чтобы убедиться, что все события находятся в пределах масштаба, поскольку ядра могут сильно различаться по флуоресценции.

Загрузите в пробирку известный контрольный образец, такой как ткань листа in vitro из образца генотипа. И отрегулируйте напряжение так, чтобы все события были в масштабе. Обратите внимание на канал пика 2C в контрольном образце.

Пики 2C экспериментальных образцов должны приходиться на одно и то же место. Загрузите экспериментальный образец клубня и еще раз убедитесь, что все события соответствуют масштабу. Если требуется регулировка, повторите регулировку напряжения контрольного образца для определения канала пиков 2С.

Вручную затворите ядра протопластов с помощью графика бокового рассеяния в зависимости от PI. Затем установите гистограмму PI так, чтобы отображалась только область ядер протопластов. Соберите нужное количество событий из каждой выборки.

Часто исследователи используют 10 000 стробированных событий для проточной цитометрии. Тем не менее, события 2000 используются здесь для образцов протопластов клубней, чтобы вместить большее количество образцов и образцы с низкими концентрациями. Генерация протопластов необходима для получения воспроизводимых результатов проточной цитометрии из клубней картофеля.

Общая морфология которого отображена здесь. Разделение между сердцевинной и перимедуллярной паренхимой проиллюстрировано черными линиями. Сосудистое кольцо, отделяющее паренхиму от коры головного мозга, обозначено черной стрелкой.

Изолированные протопласты должны быть сферическими и симметричными, а плазматическая мембрана не должна быть повреждена. Обратите внимание на разницу в размерах между протопластами листьев и клубней, а также на различия в размерах внутри ткани, которые могут указывать на разные уровни эндоредупликации. На этом рисунке показаны различия в результатах, которые могут встречаться как на графиках рассеяния проточной цитометрии, так и на гистограммах.

Интактные ядра демонстрируют четкое разделение между пиками для количественной оценки относительного изобилия клеток, в то время как интегрированные образцы пиков показывают смещенные широкие и перекрывающиеся основания. На соответствующих диаграммах рассеяния черные прямоугольники указывают на стробирование ядерных событий для гистограмм, а кластеризация событий отражается на ширине пиков гистограммы. Этот эксперимент, анализирующий уровни эндоредупликации или ЭИ, подтверждает предыдущие результаты о том, что сердцевинная ткань демонстрирует более высокий ЭИ, чем корковая ткань.

Удивительно, но профиль ткани паренхимы был похож на профиль коры головного мозга, а также значительно отличался от сердцевинной ткани. При выполнении этой процедуры важно помнить о необходимости поддержания стерильности образцов в течение первых двух инкубаций, а также держать образцы на льду как можно дольше после лизиса протопластов. После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как генетические манипуляции, чтобы ответить на дополнительные вопросы, например, какие гены влияют на уровни эндоредупликации клубней.

После просмотра этого видео вы должны хорошо понимать, как извлекать протопласты из клубней картофеля и готовить их к проточной цитометрии, чтобы исследовать уровни их эндоредупликации. Не забывайте, что работа с йодидом пропидиума может быть чрезвычайно опасной, и при выполнении этой процедуры всегда следует принимать меры предосторожности, такие как надлежащие СИЗ.