Адаптация гибридизации захвата Chromatin связанных белков для протеомики в клетках млекопитающих

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в нашем понимании регуляции генома, например, как варианты последовательностей, связанные с заболеванием, в некодирующих областях влияют на экспрессию и регуляцию генов, изменяя связывание с белками, и он может помочь идентифицировать эти белки. Основное преимущество этого метода заключается в том, что он не требует никаких генетических манипуляций с клетками или тканями, антителами и предварительного знания о ДНК-связывающих белках, которые могут взаимодействовать с ДНК в этом локусе. Демонстрировать эту процедуру будет Дану Перумалла, техник из моей лаборатории.

После конструирования олигонуклеотидов в соответствии с текстовым протоколом поместите в колбу от 2 до 5 раз по 10 до 5-й лимфобластоидной клетки или других клеточных линий в колбе Т25 с 6 мл среды RPMI 1640, дополненной 1% стрептококком Pen, 2 мил или более L-глутамином и 5% FBS. Инкубируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа. Используйте гемоцитометр или автоматический счетчик клеток для измерения плотности клеток.

Прежде чем ячейки достигнут значения от 1 до 10 до 6 клеток на миллилитр, уменьшите их до 100 раз G в течение пяти минут и переложите в колбу T75 с 25 миллилитрами среды RPMI 1640, приготовленной ранее в этом видео. Выращивайте клетки до тех пор, пока не достигнете плотности клеток от 1 до 10 до 6 клеток на миллилитр, затем переложите клетки в колбу Т150 в 38 миллилитрах той же среды и выращивайте их еще два дня. Затем раскрутите ячейки при 100-кратном G в течение пяти минут и снова суспендируйте их в 10 миллилитрах среды RPMI 1640.

Затем перелейте суспензию в роликовую бутылку площадью 1850 квадратных сантиметров, содержащую 500 миллилитров среды, и инкубируйте клетки в тех же условиях, что и раньше, только с постоянным вращением. Как только желаемое количество клеток будет достигнуто, уменьшите температуру культуры в 100 раз G в течение пяти минут и повторно суспендируйте клетки в 36 миллилитрах среды RPMI 1640. Затем переложите клеточную суспензию в коническую пробирку объемом 50 миллилитров, и удалите мелкие аликвоты для подсчета клеток и экстракции ДНК.

Чтобы сшить клетки, добавьте 1 миллилитр 37% формальдегида до конечной концентрации 1%, затем инкубируйте клетки при 10-30 оборотах в минуту при комнатной температуре в течение 10 минут. Погасите реакцию сшивания путем добавления 2 миллилитров 2,5 молярного раствора глицина до конечной концентрации 125 миллимоларов. Затем инкубируйте клетки с вращением в течение пяти минут.

После гранулирования клеток методом центрифугирования используйте ледяной 1X PBS для двукратной промывки клеток. Продолжайте лизис и очистку клеток или повторно суспендируйте гранулу в 5 миллилитрах буфера для лизиса клеток и заморозьте суспензию по каплям в жидком азоте. Затем храните образцы при температуре минус 80 градусов по Цельсию.

Чтобы провести лизис и отшелушивание, повторно суспендируйте гранулу в 20 миллилитрах буфера для лизиса клеток. Центрифугируйте клетки при 400-кратном G, при 4 градусах Цельсия в течение пяти минут. Выбросьте надосадочную жидкость и ресуспендируйте клетки в 6 миллилитрах буфера для лизиса ядер с ингибиторами протеазы.

При подготовке к ультразвуковой обработке равномерно разделите образец на шесть-восемь пробирок Microfuge. Поместите образцы на лед или холодный штатив и используйте ультразвуковой аппарат с микронаконечником для обработки ультразвуком с амплитудой 65% пятью постоянными 20-секундными всплесками, позволяя суспензии остыть в течение как минимум 40 секунд между импульсами. Центрифугируйте клетки при температуре 12 000 °G и 4 градусах Цельсия в течение 10 минут, затем перенесите надосадочную жидкость в новую пробирку и выбросьте гранулы.

После оценки общего извлечения с помощью флуориметрии образцы мгновенно замораживают. После приготовления буферов для гибридизации и промывки в соответствии с текстовым протоколом используйте 1 200 микролитров буфера для гибридизации 1X для трехкратной промывки 600 микролитров шариков. Затем используйте 1 200 микролитров буфера для гибридизации 2X для ресуспендирования гранул.

В микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл добавьте 600 микролитров образца, 120 микролитров промытых шариков, взвешенных в буфере для гибридизации 2X, и 480 микролитров буфера для гибридизации 2X. Инкубируйте пробирки при температуре 31 градус Цельсия и частоте от 30 до 60 об/мин в течение 10 минут. Затем поместите трубки на магнит, пока бусины не будут обездвижены, и переложите образцы в новые пробирки, прежде чем выбросить бусины.

Суспендируйте олигонуклеотиды захвата в рабочий раствор 10 пикомолев на микролитр, и добавьте по 4 микролитра этого раствора в каждую пробирку. Инкубируйте пробирки при температуре 42 градуса Цельсия со скоростью от 30 до 60 об/мин в течение 40 минут. Во время инкубации отложите необходимые бусины, промойте бусины три раза, как и раньше, но на этот раз используйте буфер для гибридизации 1X для их повторного взвешивания.

Добавьте промытые шарики в пробирки и инкубируйте образцы при температуре от 30 до 60 об/мин при комнатной температуре в течение 30 минут. Поместите трубки на магнит и удалите надосадочную жидкость, как только шарики будут обездвижены. После промывки шариков вытрите образец, добавив 40 микролитров молекулярной воды, и инкубируйте пробирки при температуре 94 градуса Цельсия в течение пяти минут.

Поместите трубки на магнит и подождите пару минут, пока раствор исчезнет, затем переложите надосадочную жидкость в новую пробирку, а шарики выбросьте. Храните образец при температуре минус 80 градусов Цельсия, либо приступайте к протеомному анализу согласно текстовому протоколу. Чтобы оценить выход улавливания, используйте воду молекулярного качества, чтобы разбавить аликвоту элюата в соотношении от одного до десяти.

После извлечения ДНК из аликвоты, взятой ранее в видео, используйте образец ДНК и молекулярную воду для подготовки стандартной кривой, состоящей из пяти последовательных разведений от одного до десяти. Приготовьте мастер-смесь для количественной ПЦР, добавив праймеры и зонды, и распределите соответствующее количество в каждой лунке реакции. В каждую лунку добавьте 5 микролитров либо разбавленного образца, либо стандартной кривой, либо воды молекулярного качества, чтобы они не служили в качестве контроля шаблона.

Запечатайте пластину и вращайте ее со скоростью 100 G в течение одной минуты. Затем запустите образцы в системе количественной ПЦР с использованием параметров, найденных в текстовом протоколе. Наконец, используйте стандартную кривую для оценки доходности и скремблированный захват для оценки специфичности захвата.

Здесь показаны гибридизационные захваты с использованием титрования олигонуклеотидов. Количество олигонуклеотидов постепенно увеличивается, при этом общая концентрация остается постоянной. Этот эксперимент помогает определить, сколько различных олигонуклеотидов необходимо для достижения оптимальной эффективности гибридизации.

Он также выявляет любые очевидные вредные гибридизационные взаимодействия между определенным набором олигонуклеотидов, а также наличие олигонуклеотидов с низкой специфичностью, что приводит к высокому фону. Большая часть фрагментов в сшитом хроматине не будет поддаваться гибридизационному захвату. Если захват гибридизации выполнен успешно, последующий эксперимент по захвату того же материала хроматина с использованием другого набора олигонуклеотидов захвата приведет к получению результатов, сопоставимых с выходами при использовании свежего хроматина.

Однако во втором эксперименте по улавливанию с использованием исходных олигон и хроматина, оставшегося от первого эксперимента, выход уменьшится примерно на 90%, если большая часть материала, поддающегося гибридизации, была захвачена в первом эксперименте. На этом рисунке показан захват гибридизацией различных хромосомных целевых областей, при этом каждая область служит отрицательным контролем для другой. Скремблированная последовательность также служит истинным негативным контролем.

После освоения этой техники ее можно сделать за два дня, если она выполнена правильно. При попытке выполнить эту процедуру важно помнить о том, что сначала необходимо протестировать олигонуклеотиды захвата, чтобы убедиться, что желаемая область поддается захвату гибридизации. После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как иммунопреципитация хроматина, чтобы ответить на дополнительные вопросы, например, где еще в геноме связываются идентифицированные белки, взаимодействующие с ДНК.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как выполнять HyCCAPP для обогащения интересующих областей генома с целью идентификации de novo локальных белковых взаимодействий.