Определение, если ДНК окрашивали цианиновые краска может быть переваривается с энзимами ограничения

Общая цель этого эксперимента состоит в том, чтобы переварить флуоресцентно меченые молекулы ДНК с ферментами рестрикции, чувствительными к метилированию и неметилированием, и определить скорость переваривания в эксперименте. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области химии или биологии, таких как геномика. Преимущество этого метода заключается в том, что ученый может переварить предварительно окрашенную ДНК с помощью фермента, чтобы определить, является ли ДНК полноразмерной после завершения другого эксперимента.

Демонстрировать процедуру будет Дрю Томпсон, студент бакалавриата из моей лаборатории. Чтобы приготовить 0,7%-ный агарозный гель, взвесьте 1,4 грамма агарозы с высокой температурой гелирования в колбе Эрленмейера. Затем добавьте 200 миллилитров 1x TAE буфера и поместите перевернутый стакан поверх колбы.

Нагрейте раствор на горячей плите до тех пор, пока на дне колбы не начнут образовываться пузырьки и всплывать наверх. Снимите раствор с горячей плиты и дайте ему остыть, пока к колбе нельзя будет прикоснуться голой рукой. Затем вылейте гель в гелевую форму размером 24,5 на 21,8 сантиметра с помощью гелевой расчески для создания лунок.

С помощью наконечника пипетки выдавите пузырьки рядом с расческой или на поверхности геля и дайте гелю застыть в течение как минимум 15 минут. Чтобы окрасить лямбда-ДНК шестью различными концентрациями красителей, начните с использования 1x TE для приготовления 300 микролитров 100 нанограмм на микролитр лямбда-ДНК. Храните раствор при температуре четыре градуса Цельсия.

При подготовке образца для каждой из следующих концентраций красителя для каждой полосы, ожидаемой в рестрикционном расщеплении, окрашивают от 75 до 100 нанограммов неметилированной лямбда-ДНК. Инкубируйте образцы при температуре четыре градуса Цельсия в течение ночи. На следующий день, чтобы определить, может ли фермент рестрикции переварить окрашенную ДНК, добавьте 20 единиц фермента рестрикции, три микролитра соответствующего буфера с максимальной эффективностью резки и дистиллированную автоклавную и отфильтрованную воду для реакции объемом 30 микролитров.

Поместите реакции на водяную баню с оптимальной ферментативной активностью и инкубируйте их в течение двух-четырех часов. Затем остановите реакции, добавив два микролитра 0,5 моляра ЭДТА pH 8,0. Снимите боковые стороны с заранее подготовленной формы для геля и поместите гель в бокс для электрофореза геля.

Налейте в коробку 2,5 литра 1x буфера TAE. Затем аккуратно извлеките гелевый гребень из геля, чтобы лунки были доступны. Пипеткой нанесите реакции фермента рестрикции на пластиковую пленку, и для каждого реакционного раствора добавьте один микролитр 6-кратного красителя на пять-шесть микролитров раствора ДНК.

Затем пипеткой проведите реакцию в лунки. Смешайте один микролитр одной килобазовой лестницы, девять микролитров 1x TE и два микролитра 6x загрузочного красителя. Затем загрузите раствор в лунки, которые примыкают к другим растворам.

Накройте гелевую коробку темно-синей или черной бумагой или тканью, затем подключите гелевую коробку к источнику питания. Установите блок питания на 30 вольт и включите его на ночь. Выключайте свет, пока гель течет, чтобы предотвратить фоторасщепление меченой ДНК.

На следующее утро переложите гель в лотке в емкость с 45 микролитрами бромида этидия и одним литром 1x буфера TAE. Храните контейнер при комнатной температуре в темное время суток или накройте его фольгой, чтобы предотвратить попадание света. Оставьте гель на 45 минут при комнатной температуре.

Чтобы получить изображение геля, поместите гель на вершину синего светового трансиллюминатора, который излучает максимальный световой поток от 400 до 500 нанометров. Делайте снимки с помощью камеры, прикрепленной к станции. Определите скорость переваривания для эксперимента в соответствии с текстовым протоколом.

Эффективность фермента определяется путем деления общего числа ожидаемых полос на количество видимых полос. Кроме того, для того, чтобы определить приблизительный размер полос, требуется контроль, чтобы знать, где ожидаются нативные молекулы ДНК по сравнению с окрашенной ДНК. Подвижность полос на третьей и четвертой полосах уменьшилась, в результате чего полосы сместились ближе к скважинам.

В этих полосах количество красителя не оказывает заметного влияния на подвижность, поэтому полосы соответствуют контролю. Пятая и шестая полосы показывают больше полос, чем контрольная, что указывает на частичное переваривание, предполагая, что красители повлияли на расщепление в местах узнавания. В этом эксперименте все ожидаемые полосы видны для всех концентраций красителя, поэтому игральные кости не мешали перевариванию ДНК.

Чтобы увидеть, как меняется подвижность при увеличении концентрации красителя YOYO-1, рядом с каждой полосой были вставлены цветные звездочки. Например, рядом с полосами 3,5 килобазы есть красные звездочки в каждой концентрации YOYO-1. Неожиданные полосы на пятой и шестой полосах не имеют звездочки рядом с полосами.

Пытаясь выполнить эту процедуру, важно не забыть накрыть гель темным листом бумаги и завершить растекание геля в темной комнате. Кроме того, обязательно используйте темные трубки для реакции. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как переваривать окрашенные флуоресцентно окрашенные молекулы ДНК с помощью ферментов рестрикции и определять скорость переваривания в этой реакции.

Не забывайте, что работа с бромидом этидии может быть чрезвычайно опасной, поэтому во время выполнения процедуры следует соблюдать меры предосторожности, такие как ношение перчаток и защитных очков. Кроме того, обязательно надевайте соответствующие защитные очки при использовании трансиллюминатора.