Профилирования времени репликации ДНК, используя данио рерио как в естественных условиях модель системы

Общая цель этой процедуры заключается в создании карт времени репликации ДНК всего генома эмбрионов рыбок данио-рерио на разных стадиях развития. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области клеточного цикла и биологии хроматина, например, как изменения хроматина, происходящие во время эмбрионального развития, могут повлиять на инициацию вилок репликации ДНК. Основное преимущество этого метода заключается в том, что он отображает изменения репликации, которые происходят in vivo на определенных стадиях эмбрионального развития.

Хотя этот метод может дать представление о том, как репликация ДНК изменяется во время развития рыбок данио, он также может быть применен к другим системам или модельным организмам, таким как оболочники, лягушки и мухи. Как правило, люди, плохо знакомые с этим методом, могут испытывать трудности, потому что для получения суспензий одиночных клеток из эмбрионов рыбок данио-рерио требуется некоторая практика. В ночь перед тем, как эмбрионы будут собраны, поместите десятки размножающихся взрослых особей в резервуары для разведения, используя примерно равное количество самцов и самок.

В зависимости от эксперимента используйте одну из следующих стратегий разведения. Для первой стратегии разведения поместите несколько самцов и самок данио-рерио в отдельные аквариумы для разведения и используйте разделитель, чтобы отделить самцов от самок. Если используется этот подход, создайте множество различных резервуаров для разведения и объедините эмбрионы из каждого из них, чтобы обеспечить репрезентативную биологическую изменчивость популяции.

Для стратегии разведения номер два объедините десятки самцов и самок данио-рерио в большом аквариуме для разведения. Используйте эту стратегию до тех пор, пока имеется достаточно большое количество эмбрионов. Разумно предположить, что они произошли от разных основателей и, следовательно, генетически репрезентативны для популяции.

Выполнять случки по времени, начинайте с утра, как только начнутся световые циклы. Дайте рыбам размножаться на мелководье в течение 10 минут, с двойным дном, через которое могут убежать эмбрионы. Через 10 минут соберите эмбрионы, высыпав их через ситечко и с помощью бутылки для мытья промойте в 10-сантиметровую тарелку.

Объедините все эмбрионы, собранные в один и тот же момент времени, отметьте их временем сбора и сразу же поместите в инкубатор при температуре 28,5 градусов Цельсия. Чтобы обеспечить сбор синхронно развивающихся эмбрионов, крайне важно, чтобы партии эмбрионов собирались каждые 10 минут. Это особенно важно на самых ранних стадиях эмбрионального развития.

От одной брачной пары можно ожидать сотни эмбрионов в день. Позволяйте взрослым особям размножаться 10-минутными циклами до тех пор, пока количество полученных эмбрионов не станет менее 20. Примерно через 1-1,5 часа после сбора отсортировать эмбрионы, извлечь их из инкубатора, понаблюдать за ними под микроскопом и отсортировать, чтобы удалить мертвые и неоплодотворенные яйца.

Посчитайте эмбрионы, и поместите их с плотностью 100 эмбрионов на 10-сантиметровую пластину. Добавьте свежую среду E3 и верните эмбрионы в инкубатор с температурой 28,5 градусов по Цельсию. Когда эмбрионы достигнут желаемой стадии развития, проверьте стадию морфологически под световым микроскопом в соответствии со стадиями эмбрионального развития рыбок данио

Если эмбрионы 48 hpf или младше, перенесите до 1500 стадийных эмбрионов в 15-миллилитровую коническую трубку и используйте E3 для их промывания несколько раз. На каждые 100 эмбрионов добавьте один миллилитр Е3 и 20 микролитров раствора проназы и аккуратно перемешайте. До 1500 эмбрионов могут быть дехорионированы в одной пробирке с 15 миллилитрами Е3. Положите пробирку на бок и расположите эмбрионы ровным слоем, чтобы обеспечить максимальное соотношение поверхности к объему.

Осторожно помешивайте трубку каждые две-три минуты, пока все хорионы не отпадут от эмбрионов. Общее время дехорионации будет варьироваться в зависимости от активности проназы. Удалите надосадочную жидкость и, с 10 миллилитрами Е3, аккуратно промойте эмбрионы три раза.

После помещения эмбрионов на лед и удаления оставшегося E3 используйте один миллилитр свежеприготовленного, ледяного буфера для удаления отпечатков на каждые 500 эмбрионов для промывки образца. Затем с помощью P1000 аккуратно пипетируйте эмбрионы вверх и вниз от пяти до 10 раз, чтобы нарушить желточный мешок. Затем перелейте один миллилитр в 1,5-миллилитровую микропробирку и центрифугируйте образец при температуре четыре градуса Цельсия и в 500 раз сильнее силы тяжести в течение пяти минут.

Образцы должны быть дозированы достаточно энергично, чтобы создать одноклеточную суспензию без лизиса клеток. Этот шаг потребует некоторой практики. Удалите надосадочную жидкость и используйте один миллилитр ледяного 1x PBS для промывки гранулы, чтобы удалить раствор Рингера.

Затем снова центрифугируйте образец. Осторожно удалите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клетки в одном миллилитре 1x PBS. Затем поместите трубку на лед.

Добавьте три миллилитра ледяного этанола в 15-миллилитровую коническую трубку и осторожно переведите трубку с этиленоксидом на низкую температуру. Используя P1000, медленно капните суспензию эмбриональных клеток рыбки данио в EtOH, продолжая при этом делать вихрь. Добавьте в общей сложности один миллилитр суспензии клеток эмбриона для окончательной фиксации раствора 75% EtOH.

После того, как будет добавлен один миллилитр клеточной суспензии, аккуратно покрутите пробирку для смешивания и положите ее на бок при температуре минус 20 градусов Цельсия не менее чем на один час или храните суспензию в морозильной камере в течение двух-трех недель. Чтобы окрасить эмбриональную ДНК, после удаления EtOH-фиксированных клеток эмбриона с отрицательных 20 градусов Цельсия, центрифугируйте пробирку при 1500-кратном давлении и четырех градусах Цельсия в течение пяти минут. Поместите трубку на лед и осторожно удалите надосадочную жидкость.

Затем, используя P1000, аккуратно ресуспендируйте клетки в одном миллилитре свежеприготовленного холодного PBS-BSA. Центрифугируйте ячейки при 1500-кратной гравитации и четырех градусах Цельсия в течение пяти минут и поместите образец на лед. Затем удалите надосадочную жидкость и на каждые 1000 эмбрионов добавьте 200 микролитров окрашивающего раствора йодида пропидиума и повторно суспендируйте клетки.

Дайте клеткам поинкубироваться в растворе PI в течение 30 минут на льду, осторожно перемешивая каждые пять минут. Поместите 40-микрометровый нейлоновый фильтр на 50-миллилитровую коническую трубку со льдом. Затем аккуратно пипетируйте клетки для смешивания и отфильтруйте клеточный раствор через сетку.

С помощью плоского внутреннего конца поршня шприца аккуратно разбейте все оставшиеся комки клеток на сетке. На каждые 1000 эмбрионов используйте 500 микролитров холодного PBS-BSA для промывки клеток через фильтр. Поместите ячейку размером 40 микрометров на 15-миллилитровую коническую трубку на льду и отфильтруйте клеточную суспензию из 50-миллилитровой конической трубки второй раз в 15-миллилитровую трубку.

Наконец, используя соответствующий прибор для сортировки клеток, установите лазерное возбуждение на 561 нанометр и детектирование излучения на 610 на 20, чтобы обнаружить йодид пропидия. Отсортируйте ячейки, и проведите дополнительные анализы в соответствии с текстовым протоколом. Чтобы определить качество считываемого картирования, данные секвенирования должны быть сначала выровнены по геному, используя статистику значений mapQ.

Кроме того, рассчитанная статистика длины считывания строится в виде гистограммы распределения размеров вставок для всех последовательных считываний. Этот конкретный эксперимент привел к медиане 170.о. Эта гистограмма иллюстрирует статистику чтения для общего количества картированных прочтений, прочтений, содержащих флаг низкого качества, прочтений с парами, отображенными на другую хромосому, прочтений с парой, выходящей за порог расстояния, и дубликатов ПЦР.

Репрезентативное количество общего картографированного, некартированного и непарного прочтений, охвата и разрешения чтения для типичного прогона секвенирования образца рыбки данио перечислены здесь. После фильтрации количество прочтений определяется в окнах переменного размера, а данные сглаживаются и нормализуются. Здесь показаны типичные сглаженные и нормализованные временные профили репликации репрезентативной хромосомы данио-рерио для биологических репликатов.

Профили биологических и экспериментальных реплик должны быть очень похожими, а также демонстрировать высокую корреляцию по длине хромосомы. Профили также должны демонстрировать высокую корреляцию между временными значениями по всему геному. Цветовая карта представляет коэффициент корреляции Пирсона.

Пытаясь выполнить эту процедуру, очень важно помнить о том, что необходимо обеспечить синхронный сбор эмбрионов. После этой процедуры могут быть применены другие методы, такие как инъекции морфолино или мутагенез CRISPR-Cas9, чтобы ответить на дополнительные вопросы, например, каковы механизмы, с помощью которых репликация ДНК координируется с другими процессами развития? После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как собирать клетки на определенных этапах клеточного цикла из синхронно развивающихся эмбрионов данио-рерио.

Сбор этих образцов имеет решающее значение для создания временных карт репликации ДНК всего генома.