Оптимизация мультиплекс на базе РНК выражение Assay, с использованием архивных материалов рака молочной железы

Этот метод успешно оптимизирован для классификации пациентов с раком молочной железы на известные и неизвестные терапевтические группы. Высокая чувствительность этого анализа позволяет идентифицировать гетерогенные образцы, которые могут быть дополнительно изучены с помощью лазерной микродиссекции. Основным преимуществом мультиплексного анализа на основе РНК является воспроизводимость результатов с использованием гематоксилина и архивного материала, содержащего фиксированный парафин с эозином, что позволяет получать результаты с высоким разрешением и валидацией биомаркеров.

Подготовьте ткань так, как описано в текстовом протоколе. Чтобы начать вскрытие, установите пределы стекла и откалибруйте ход предметного стекла микроскопа. Теперь отсканируйте окрашенные предметные стекла пленки с помощью объектива 4X.

Выделите и обведите целевые участки для микродиссекции на предметном стекле мембраны. Следите за общей площадью. Для адекватного анализа РНК необходимо не менее 42 квадратных миллиметров.

Затем инициируют лазерную резку при заданных параметрах. Затем с помощью механизма подъема крышки извлеките рассеченный участок и установите его на колпачок диффузора пробирки с маркировкой, прикрепленной к механическому придатку. Если рассеченный срез не прикрепляется к колпачку, повторите рассечение целевой области.

Точность микродиссекции является критически важным этапом, и всегда следует следить за тем, чтобы микрорассеченная область, присутствующая на колпачке, совпадала с отмеченным, отсканированным изображением. Соберите столько срезов ткани, сколько нужно, каждый в отдельную пробирку, затем приступайте к лизизированию образцов ткани. Для лизиса нанесите 2,4 микролитра гомогенизирующего раствора предварительно на квадратный миллиметр площади ткани в каждый образец, затем переведите образцы на вихревой поток в течение 10 секунд с максимальной скоростью.

Затем уменьшите количество образцов в течение пяти секунд при 2 500 g. Затем переложите образцы в 1,5-миллилитровые пробирки, если это необходимо, и поместите в встряхивающий нагревательный блок при температуре 65 градусов Цельсия. Встряхивайте их при 600 об/мин в течение 12–18 часов.

Затем центрифугировать лизаты при 21 000 г в течение пяти минут при комнатной температуре. Аккуратно соберите прозрачную надосадочную жидкость в новую пробирку с маркировкой. Избегайте переноса фрагментов тканей.

Надосадочная жидкость может храниться при температуре минус 80 градусов по Цельсию. После подготовки всех реагентов для проведения гибридизационного анализа загрузите до 90 лунок 96-луночного планшета магнитной сепарации с 25 микролитрами гомогената тканей. Загрузите 25 микролитров контрольных образцов в три назначенные лунки и загрузите 25 микролитров гомогенизирующего раствора в три лунки в качестве заготовок.

Затем запечатайте магнитную разделительную пластину с помощью прозрачного пластикового герметичного пломба и поместите пластину в инкубатор с температурой 54 градуса Цельсия на 18-22 часа с встряхиванием. На следующий день установите и зафиксируйте пластину на ручной магнитной шайбе для пластин, затем снимите герметичное уплотнение и подождите одну минуту, пока магнитные шарики осядут. Теперь выполните промывку.

Слейте воду с тарелки над раковиной и аккуратно промокните ее насухо с помощью папиросной бумаги, затем загрузите во все лунки 100 микролитров буфера для стирки 1X и подождите 15 секунд. Повторите этот процесс три раза, чтобы завершить этап стирки. После снятия последней промывки повторно загрузите лунки 50 микролитрами реагента предварительного усилителя, затем запечатайте пластину алюминиевым герметиком для пластин и встряхните пластину при 800 об/мин в течение одной минуты при комнатной температуре.

Затем продолжайте встряхивать тарелку при температуре 50 градусов Цельсия в течение часа. Когда это будет готово, выполните еще одну процедуру стирки. Затем перезагрузите лунки с 50 микролитрами реактива-усилителя, загерметизируйте пластину алюминиевой пластиной и повторите инкубацию встряхиванием в течение одной минуты при комнатной температуре, а затем час при 50 градусах Цельсия, после чего следует еще один этап промывки.

зонд на этикетку в течение 10 секунд на максимальной скорости, а затем добавьте по 50 микролитров зонда для этикетки в каждую лунку. Затем снова запечатайте пластину и повторите инкубацию встряхиванием, как и раньше, после чего следует еще один этап промывки. Затем загрузите в лунки 50 микролитров свежесмешанного стрептавидина фикоэритрина, затем выполните встряхивающую инкубацию при комнатной температуре при 600 об/мин, после чего следует этап промывки с использованием промывочного буфера для стрептавидина.

После завершения этапа промывки загрузите в каждую лунку по 100 микролитров промывочного буфера стрептавидина и запечатайте пластину алюминиевым уплотнителем, затем встряхните пластину при 800 об/мин при комнатной температуре в течение трех минут. На последнем этапе инкубации запустите магнитный анализатор шариков и убедитесь, что прибор откалиброван и выполнены протоколы валидации. В программном обеспечении добавьте новый анализ, выбрав Создать пакет с использованием существующего протокола на вкладке Пакеты.

Затем в схеме пластин обозначьте лунки как неизвестные или пустые и укажите метку для каждой из них на панели Образец. Теперь снимите алюминиевое уплотнение с реакционной пластины, извлеките лоток загрузчика пластин и загрузите пластину в анализатор. Затем нажмите Retract, затем Run Batch, чтобы запустить анализатор.

После считывания извлеките пластину и очистите магнитный анализатор шариков в соответствии с рекомендациями производителя. Для анализа перейдите на вкладку Результаты пакетной обработки. Выберите соответствующий файл анализа и воспользуйтесь опцией для его экспорта в виде файла csv, а затем создайте средние и необработанные баллы с помощью программного обеспечения для работы с электронными таблицами.

Убедитесь, что элементы управления отображают ожидаемые сигналы. Нормализуйте выборку исходных данных и проанализируйте распределение данных с помощью платформы обработки и анализа данных или с помощью определенных алгоритмов для выполнения анализа принципиальных компонент. Производительность мультиплексного считывателя шариков и анализа имеет решающее значение, а выполнение последовательных разведений хорошо аннотированных контрольных образцов перед получением ценных образцов пациента обеспечивает получение правильных результатов.

В качестве атрибутов выберите подмножество нормализованных данных о гене и номинальную переменную, например подтип рака молочной железы. Применение обученного и проверенного алгоритма классификации для определения характеристик неизвестных образцов. Описанный метод был применен для одновременного измерения 40 транскриптов в окрашенном H&E, микродиспарированном, сильно деградированном материале FFPE.

Используя этот метод, можно показать точную характеристику рецепторного статуса и дифференциальной экспрессии мезенхимального маркера FN1 при сравнении опухоли и соответствующей контрольной ткани в различных рецептор-положительных и негативных подтипах. С помощью этого метода можно охарактеризовать гетерогенность внутри опухолей. ER-положительная опухоль демонстрирует пространственную дифференциальную экспрессию FN1 в областях, демонстрирующих отчетливую морфологию опухоли и митотическую активность.

После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее представление о том, как измерить несколько генов непосредственно из лизатов тканей после гибридизации целевой РНК с гранулами, усиления сигнала и количественной оценки. Чувствительность анализа позволяет использовать лазерный микродиссекционный материал. При попытке выполнить эту процедуру важно помнить о калибровке оборудования перед каждым анализом и определении диапазона чувствительности с использованием материалов для контроля качества перед обработкой ценных образцов пациента.

Рабочий процесс анализа легко адаптируется к клиническим лабораториям. Профилирование РНК до 90 образцов может быть выполнено за 12 часов в течение двух дней. Измерение состояния рецепторов рака молочной железы в патологической лаборатории занимает много времени и требует опытных патологоанатомов.

Использование этого оцифрованного, мультиплексного анализа на основе гранул позволяет точно количественно определить экспрессию РНК. Анализ фракционных биомаркеров в биопсии при первичном диагнозе является проявлением опухоли. Использование этой методологии с более широкой панелью биомаркеров, а также использование целых срезов идентифицирует гетерогенные образцы.

Разработка анализов с использованием этой методологии универсальна и требует минимального ввода образца. Образцы включают клинические аннотированные образцы, важные для валидации биомаркеров, а также жидкие биопсии, которые важны для наблюдения за пациентами и ранней диагностики.