Проверка роли физических сил в начале Чик эмбриональных морфогенез

Общая цель этого экспериментального протокола заключается в изучении роли механических сил в раннем развитии эмбрионального мозга с помощью экспериментов ex ovo. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы биологии развития и биомеханики, такие как роль механических сигналов в морфогенезе, то есть создании биологической формы. Основное преимущество этой методики заключается в том, что она позволяет охарактеризовать роль механических сил в морфогенезе на уровне тканей и организма.

Чтобы начать эту процедуру, используйте деликатные салфетки с 70% этанолом для очистки оплодотворенных яиц белых леггорнов без специфических патогенов. Затем разложите яйца в продольной ориентации на держателе. После этого установите инкубатор для яиц на целевую температуру 37,5 градусов Цельсия и поддерживайте влажность на уровне от 48 до 55%. Влажность контролируется добавлением соответствующего количества воды в инкубатор

Инкубируйте яйца в течение примерно 40-44 часов до HH11-13. После этого дайте яйцам остыть при комнатной температуре примерно от 15 до 30 минут перед очисткой 70% этанолом. На этом этапе разбейте яйца со дна, аккуратно раздвиньте скорлупу и осторожно положите содержимое в чашку Петри размером 150 на 15 миллиметров.

Чтобы убедиться, что эмбрион находится вверх, держите яйца в той же ориентации, в которой они были инкубированы, во время их раскалывания. Удалите тонкий альбумин с помощью одноразовой пастеровской пипетки. Отделите густой альбумин от желтка с помощью щипцов с тупым концом.

Убедитесь, что густой альбумин был удален, слегка соскребая верхнюю часть желтка. Затем с помощью щипцов с тонким наконечником поместите на эмбрион кольцо из фильтровальной бумаги и центрируйте его, совпадая между длинной осью кольца и длинной осью эмбриона. Впоследствии разрежьте ножницами желток, окружающий кольцо фильтровальной бумаги.

После этого потяните кольцо и зародыш за желток в косом направлении к месту, где желток был впервые надрезан. Затем промойте зародыш в двух последовательных 100-миллиметровых посудах с комнатной температурой PBS. Далее поместите кольцо фильтровальной бумаги в 35-миллиметровую чашку Петри.

Положите эмбрион тыльной стороной вверх на другую фильтровальную бумагу в 35-миллиметровой чашке Петри. После этого поместите кольцо из нержавеющей стали поверх бутерброда из фильтровальной бумаги. Следите за тем, чтобы не повредить эмбрион.

Теперь добавьте по три миллилитра ранее приготовленного СКК в каждую чашку Петри. Удалите вителлиновую мембрану каждого эмбриона, слегка проведя вытянутой капиллярной иглой по верхней части эмбриона. Затем снимите виллиновую мембрану, начиная с переднего конца и переходя к хорде.

После этого поместите восемь 35-миллиметровых чашек Петри в одну 150-миллиметровую тарелку, выстланную пропитанными водой салфетками для поддержания влажности. Затем поместите 150-миллиметровую чашку Петри в герметичный пластиковый пакет и наполните пакет газовой смесью, состоящей на 95% из кислорода и на 5% из CO2. Закройте пакет и поместите его в инкубатор с температурой 37,5 градусов Цельсия.

Теперь извлеките эмбрион из инкубатора и используйте ОКТ-систему для его визуализации и определения крутильного угла нервной трубки. Перенесите эмбрионы в световой микроскоп и визуализируйте их с 10-кратным увеличением. С помощью пипетки объемом 200 микролитров постепенно удаляйте 0,2 миллилитра среды из чашки Петри.

Делайте снимки в светлом поле после каждого раунда удаления носителя, чтобы наблюдать за влиянием интерфейса среда-воздух на эмбрион. Продолжайте удалять среду до тех пор, пока поверхностное натяжение на эмбрионе не вызовет скручивание. Визуализируйте эмбрион с помощью ОКТ-системы еще раз, чтобы установить окончательный угол кручения для сравнения с контрольными эмбрионами.

Чтобы изменить направление сердечной петли, с помощью щипцов переверните фильтровальную бумагу так, чтобы эмбрион стал вентральной стороной вверх. Затем с помощью вытянутой капиллярной трубки разрежьте щель в спланхноплевральной мембране и приложите механическую силу, чтобы протолкнуть сердце с правой стороны на левую. Примените поверхностное натяжение жидкости, чтобы сердце оставалось на левой стороне.

Затем инкубируйте эмбрион еще 20 часов, чтобы увидеть изменение хиральности кручения. Здесь показан собранный эмбрион с удалением VM в HH11. Тот же эмбрион инкубировался в течение 27 часов после удаления VM, демонстрируя уменьшенную крутильную деформацию.

Вот тот же эмбрион, который подвергся перекрутке мозга под действием поверхностного натяжения жидкости, а вот контрольный эмбрион с нормальным перекрутом мозга на сопоставимой стадии. При попытке выполнить эту процедуру важно быть осторожным, чтобы не повредить эмбрион. Следуя этой процедуре, можно использовать другие методы, такие как анализ методом конечных элементов, чтобы вычислительно смоделировать, как физические силы могут влиять на морфологию.

Таким образом, этот метод, разработанный здесь, проложил путь для будущих исследований механики морфогенеза у куриных эмбрионов. После просмотра этого видео вы должны понять, как собирать эмбрионы цыплят для культивирования in vitro, микрохирургически удалять мембрану вителлина, повторять силу, обеспечиваемую мембраной вителлина, и контролировать морфологию эмбриона с помощью ОКТ и визуализации в светлом поле.