Изоляция мезенхимальных стволовых клеток человека надкостницей альвеолярного и эффекты витамина d на Остеогенные активность клеток, надкостницы, полученных

Общей целью данного исследования является изучение остеоиндуктивного воздействия витамина D на культивируемые мезенхимальные стволовые клетки, которые были собраны из альвеолярной надкостницы зубов. Использование мезенхимальных стволовых клеток является большим шагом вперед в стоматологии за последнее десятилетие. Они были успешно выделены и культивированы из многих участков зубной ткани.

Цель, однако, состоит в том, чтобы выделить и культивировать мезенхимальные стволовые клетки из альвеолярной надкостницы и исследовать остеоиндуктивный потенциал соединения витамина D. Вообще говоря, люди, плохо знакомые с этим вопросом, будут испытывать трудности из-за новой идеи формирования костей в мезенхимальных стволовых клетках, полученных из альвеолярной надкостницы. Сотрудники лаборатории будут демонстрировать процедуру мисс Синь-Вэнь Чи. Она

научный сотрудник моей лаборатории. Для начала забор надкостничных тканей у пациентов во время стоматологической операции с помощью надкостничного сепаратора. Собирайте ломтики, которые примерно два на пять миллиметров.

Храните срезы тканей в DPBS с антибиотиками. В лаборатории с помощью скальпеля тщательно измельчите фрагменты альвеолярной надкостничной ткани в течение 24 часов после забора. Далее культивируйте ткань на 35-миллиметровых чашках Петри в соответствующую среду для культивирования.

Используйте увлажненный инкубатор с температурой 37 градусов Цельсия и содержанием углекислого газа 5%. Через три дня выбросьте собранные надкостничные ткани и смените среду. Когда клетки пролиферируют примерно до 80% конфлюенции, отделите культивируемые клетки, добавив трипсин.

И инкубирование культуры в течение трех минут. После этого добавьте 0,8 миллилитра среды, чтобы прекратить отслоение. После сбора и подсчета распределите по 5 000 клеток в одном миллилитре на тарелку.

На этом этапе отметьте пластинчатые ячейки как проходные. Культивируйте эти клетки и разделяйте их снова после того, как они пролиферируют до 80% слияния. Среда с пассажем изначально оранжево-красного цвета.

Когда через три дня среда начнет окрашиваться в оранжевый цвет, смените ее. Когда проход одной клетки достигает 80% слияния, создайте клетки со второго по пятое поколение, повторяя те же процедуры, которые использовались для подготовки нулевого поколения к первому поколению. Меняйте среду два раза в неделю.

Четыре недели спустя оцените потенциал клеток к дифференцировке в остеогенную линию, наблюдая за морфологией клеток под микроскопом. Стволовые клетки с помощью теста фон Косса. Этот анализ позволяет определить наличие кальцинированных отложений в вашей культуре.

Промойте клетки с помощью PBS и зафиксируйте их на 30 минут в одном миллилитре 10%-ного формалина. После этого удалите формалин, а затем промойте клетки и обработайте их 5% нитратом серебра. Подвергайте клетки воздействию ультрафиолетового излучения в течение одного часа.

Затем удалите нитрат серебра и обработайте клетки двумя миллилитрами 5% сульфата натрия четыре раза в течение трех минут каждый раз. Заменяйте раствор между процедурами. Наконец, дважды промойте клетки, используя дистиллированную воду.

В 20 из 34 образцов надкостничной ткани были успешно получены колонии стволовых клеток, полученных из костного мозга. Не было обнаружено каких-либо факторов по отношению к донорам, которые могли бы существенно повлиять на успех культивирования. Первоначально PDC образовывали колонии и сферические кластеры со смесью круглых и веретенообразных клеток.

После первого пассажа клетки были однородно фибробластоподобными с веретенообразной формой. По окончании остеогенной дифференцировки анализ фон Косса указал на возможное наличие отложений кальция и остеогенную дифференцировку. Эти результаты убедительно указывают на то, что среди популяций периостальных клеток клетки-предшественники обладают потенциалом к дифференцировке в остеогенные клетки.

Остеогенные клетки-предшественники также обрабатывали кальцитриолом и исследовали с помощью ОТПЦР для оценки уровня экспрессии щелочной фосфатазы, которая является сильным индикатором ранней остеогенной дифференцировки клеток. Как лечение витамином С, так и кальцитриолом, активным метаболитом витамина D, повышает экспрессию щелочной фосфатазы. Кроме того, экспрессия мРНК уровня коллагена и мРНК увеличилась в ответ на те же методы лечения.

Было обнаружено, что экспрессия мРНК костного сиалопротеина увеличивается в клетках, обработанных более высокой концентрацией кальцитриола. Однако экспрессия КБЖК 1 и мРНК остокальция не реагировала на лечение. После просмотра этого видео у зрителей должно сложиться хорошее представление о протоколе минерализации и культивирования альвеолярной надкостницы человека.

После того, как вы освоите эту задачу, ее можно выполнить за четыре-пять недель, если все правильно выполнить. При проведении этого эксперимента важно использовать тщательную и стерильную технику, чтобы избежать загрязнения клеток.