Химические ампутации и регенерации глотки в Планарии Schmidtea mediterranea

Общая цель этой процедуры ампутации заключается в выборочном и полном удалении глотки у планарий, не повреждая другие органы. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области регенерации. Например, как стволовые клетки распознают отсутствующие органы и инициируют их регенерацию.

Основное преимущество этой методики заключается в том, что она очень точная и в том, что другие органы не повреждаются во время процесса. Впервые идея этого метода пришла мне в голову, когда я анестезировал планарий азидом натрия. Я заметил, что воздействие азида натрия вызывало выскакивание глотки.

Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, так как ампутация требует правильного отбора животных, а также тщательного наблюдения за движениями и морфологией животных. Демонстрировать процедуру будет Дивья Ширур, аспирантка моей лаборатории. Перед началом процедуры с помощью пластиковой переносной пипетки выберите червей, которых кормили пять-семь дней назад в чистую чашку Петри.

Подложите плоскую линейку под чашку Петри, чтобы убедиться, что каждая планария имеет длину не менее 6 миллиметров, когда они ползают по чашке. Затем переложите до 20 отобранных червей в 35-миллиметровую чашку Петри и с помощью переводной пипетки удалите всю плоскостную воду из чашки. Поместите чашку под стереомикроскоп и отрегулируйте увеличение таким образом, чтобы можно было увидеть несколько животных.

Добавьте в блюдо пять миллилитров свежеприготовленного 100 миллимолярного раствора азида натрия. Понаблюдайте за животными, не двигая миску в течение трех-четырех минут, чтобы понаблюдать за выдавливанием глотки. Когда по крайней мере половина животных в чашке полностью вытянет глотку, используйте пластиковую переносную пипетку для аспирации и принудительно распределите червей вокруг чашки несколько раз.

Если какие-либо фаринги были полностью расширены, это энергичное пипетирование приведет к их отделению. В качестве альтернативы используйте пару тонких щипцов, чтобы захватить глотку, поднимая планарию вверх к мениску. Когда животное поднимается, поверхностное натяжение приводит к тому, что глотка отделяется.

Во время перемещения глотки будьте осторожны, чтобы не нанести случайные травмы животным. Планарии очень мягкие и легко повреждаются, особенно при использовании азида натрия. С помощью передаточной пипетки переместите около 15 ампутированных животных в новую посуду со свежей планарической водой и трижды промойте червей свежей планарической водой.

Обязательно полностью смойте азид натрия. Даже следы химического вещества могут привести к тому, что животные начнут лизываться. Затем инкубируйте червей при температуре 20 градусов Цельсия в течение семи дней.

На следующий день после ампутации поместите червей обратно под микроскоп, чтобы определить, видно ли темное пятно на тыльной стороне червя. Чтобы накормить червей, перелейте соответствующий объем печеночной пасты в микроцентрифужную пробирку и кратковременно центрифугируйте пробирку, чтобы удалить любые пузырьки воздуха. Оценив объем пасты в грануле, добавьте плоскую воду до одной пятой от ее объема.

Исходя из общего объема в тюбике, добавьте двухпроцентный красный пищевой краситель. Тщательно перемешайте образец пищи до тех пор, пока краситель не равномерно распределится по всей пасте, и снова кратковременно центрифугируйте пробирку. Переложите ампутированных животных в новую чашку Петри и поставьте в темноте примерно на один час.

В конце инкубации отрежьте примерно полсантиметра от конца наконечника пипетки P200 и с помощью модифицированного наконечника переложите в чашку 25 микролитров пасты из красной печени. Дайте животным покормить в течение 30 минут. Затем поместите червей на белый фон, чтобы подсчитать количество животных, которые кажутся красными.

Примерно через 6 минут в растворе азида натрия можно увидеть белый кончик глотки. Через несколько минут животные активно сокращаются и с силой выбрасывают глотку из своего тела. Примерно через 11 минут воздействия азида животные расслабляются, и в этот момент становится отчетливо видна характерная колокольчатая форма глотки.

Теперь он готов к ампутации. Удаление этой большой непигментированной массы ткани приводит к появлению темного пятна на спинной стороне ампутированных животных. Чтобы более точно контролировать регенерацию глотки, животных можно окрашивать флуоресцентно конъюгированным стрептавидином на ночь.

Комбинируя пищевой краситель с печеночной пастой, животных, которые едят, можно отличить от животных, которые не едят. Количество красных животных затем может быть количественно определено, чтобы оценить процент животных с функциональным глоткой. После освоения этой техники ее можно освоить за 20 или 30 минут.

Пытаясь пройти эту процедуру, не забывайте внимательно следить за движениями планарий, чтобы точно определить, когда следует начать ампутацию. Селективные ампутации могут помочь решить такие вопросы, как то, как стволовые клетки инициируют соответствующие решения о происхождении для достижения регенерации. Это видео должно дать хорошее понимание того, как выполнять избирательное удаление глотки с помощью азида натрия.

Работа с азидом натрия может быть крайне опасной. Не забывайте всегда обращаться с ним в перчатках, правильно выбрасывать отходы и убирать рабочее место после эксперимента.