Размер имеет значение: Измерение диаметра капсулы в Cryptococcus neoformans

Общая цель этой процедуры заключается в окрашивании полисахаридной капсулы штаммов C.neoformans для визуализации и измерения диаметра капсулы. Эти методы могут помочь исследователям в индукции, визуализации и измерении размера капсулы у Cryptococcus neoformans. Основное преимущество методов окрашивания и визуализации заключается в том, что они просты, быстры и позволяют точно измерить диаметр капсулы.

Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, так как шаги программного обеспечения могут быть запутанными при первом использовании. Диаметр капсулы Cryptococcus neoformans' часто используется в качестве меры вирулентности. Возможность автоматизации этого процесса может значительно сэкономить время анализа.

Чтобы стимулировать производство капсул, сначала инкубируйте колонию C.neoformans в бульоне пептон-декстрозы дрожжей при температуре 37 градусов Цельсия с встряхиванием в течение 18-36 часов, пока культура не перейдет в логарифмическую фазу. По окончании культивирования дрожжи гранулируют центрифугированием и трижды промывают дрожжи в ПБС. После последней промывки повторно суспендируйте дрожжи в соотношении от 10 до пятой клетки на два миллилитра концентрации DMEM и инкубируйте культуру при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа в течение 18 часов.

На следующий день соберите клетки центрифугированием и удалите все микролитры надосадочной жидкости, кроме последних. Чтобы окрасить дрожжи индийскими чернилами, повторно суспендируйте гранулу в оставшейся надосадочной жидкости и перенесите четыре микролитра клеточной суспензии и четыре микролитра индийских чернил на предметное стекло микроскопа. Аккуратно перемешайте полученный раствор, не создавая пузырьков.

Затем поместите на образец ячейки покровный стекло толщиной 1,5 толщиной 13 миллиметров и запечатайте края нетоксичным герметиком. Для окрашивания дрожжей флуоресцентным красителем суспендировать на ночь культуральную гранулу в 50 микролитрах PBS с добавлением 1%-ной бычьей сыворотки и инкубировать клетки в 55-60 микролитрах калькофтор-белого и конъюгированной капсуле Alexa Fluor 488 моноклонального антитела 18B7 в течение 30 минут при 37 градусах Цельсия. В конце инкубации соберите клетки центрифугированием и повторно суспендируйте гранулу в 10 микролитрах PBS плюс бычий сывороточный альбумин

Затем перенесите восемь микролитров клеток на предметное стекло микроскопа, накройте образец клетки 1,5 толщиной 13 миллиметрового стекла и заклейте края нетоксичным герметиком. Чтобы окрасить дрожжи обоими красителями, сначала инкубируйте клетки с флуоресцентной капсулой и окрашивайте клеточную стенку, как показано выше. Затем добавьте четыре микролитра флуоресцентно окрашенных клеток и четыре микролитра индийских чернил на предметное стекло и накройте образец грибковой клетки герметичным покровным стеклом, как показано на рисунке.

Чтобы получить изображение клеток с помощью световой микроскопии, выберите объектив 100X и получите изображение не менее 50 неперекрывающихся клеток в каждом условии с оптимизированным временем экспозиции, чтобы максимизировать контраст изображения и свести к минимуму размытие, вызванное небольшими движениями клеток. Чтобы получить изображение клеток с помощью флуоресцентной микроскопии, откройте программное обеспечение для визуализации микроскопа и выберите соответствующие длины волн возбуждения и излучения для используемых флуорофоров. В панели управления стеком Z выберите первый последний вариант.

Используя управление точной фокусировкой на микроскопе, сначала сфокусируйтесь ниже самой широкой точки клеточного тела одной дрожжевой клетки и капсул для всех клеток в текущем поле зрения, а затем нажмите кнопку «Установить». Затем используйте регулятор точной фокусировки, чтобы сфокусироваться над самой широкой точкой тела клетки той же клетки и капсулы для всех ячеек в текущем поле зрения, и нажмите «Установить последним». Затем откройте вкладку сбора данных и нажмите кнопку Начать эксперимент, чтобы получить стек Z для текущей позиции.

Чтобы вручную измерить диаметр капсулы и ячейки, откройте соответствующую программу измерения ячейки и выберите изображение, которое необходимо измерить. Выберите «Измерить» и с помощью курсора проведите прямую линию через самую широкую точку всей ячейки, чтобы измерить общий диаметр ячейки. Нажмите кнопку «Измерить» еще раз и проведите прямую линию через тело клетки, чтобы измерить диаметр тела клетки и открыть следующую ячейку.

Когда все ячейки будут измерены, сохраните изображения. Для автоматического измерения диаметров капсулы и ячейки сначала откройте соответствующую программу редактирования изображений и инвертируйте все изображения ячеек, окрашенных индийскими чернилами. Затем, чтобы импортировать исходное и инвертированное изображения в программное обеспечение для измерения ячеек, откройте меню «Файл» в программе измерения и выберите «Импортировать последовательность», «Загрузить изображение», «Определить последовательность вручную», «Определить канал измерений», «Импорт» и «Применить».

Чтобы обнаружить и замаскировать тело клетки, выберите протокол флуоресценции анализатора колоний для первого интересующего вас инвертированного изображения и нажмите кнопку «Применить». Снова выберите протокол флуоресценции анализатора колоний, чтобы сегментировать инвертированные изображения тел клеток C.neoformans из их капсул, и нажмите кнопку «Применить» еще раз, чтобы создать маску подсчета. Щелкните правой кнопкой мыши, чтобы переименовать подсчет, маскировать тело клетки, и используйте протокол пролиферации клеток на исходном изображении для обнаружения и маскировки капсулы.

Нажмите кнопку «Применить», чтобы создать маску счетчика для исходного изображения и переименовать капсулу маски счетчика. Чтобы создать новую маску поверх исходного изображения, чтобы отделить соседние капсулы друг от друга, выберите капсульную секцию и капсулу для области капсулы. Чтобы экспортировать данные, нажмите на таблицу, затем нажмите на иконку экспорта в таблицу.

Выберите измерения, которые вы хотите экспортировать, а затем сохраните данные. Увеличение размера капсулы очевидно у большинства штаммов после индукции, хотя некоторые штаммы демонстрируют естественно маленькие капсулы. В этом репрезентативном эксперименте постоянно наблюдалась значительная разница в размере капсулы между самым большим штаммом и двумя меньшими штаммами.

Различия в размере капсул также можно обнаружить с помощью флуоресцентных красителей. Захват изображений с помощью стека Z гарантирует, что для каждой клетки будет получен максимальный диаметр капсулы и тела клетки. Затем стеки могут быть обработаны для получения проекций максимальной интенсивности для ручного измерения капсулы дрожжевой клетки и диаметра клетки.

Существенной внутриэкспериментальной разницы между измерениями капсул с использованием любого из методов окрашивания нет, хотя при использовании индийских чернил для измерения диаметров капсул наблюдается большая вариабельность между экспериментами по сравнению с окрашиванием флуоресцентными красителями. Значительные различия в измерениях диаметра капсулы между различными исследователями обычно не наблюдаются независимо от используемого метода, в то время как небольшие, но значимые различия в размере капсулы могут быть обнаружены с помощью автоматизированного метода измерения. Для успешного автоматизированного измерения клетки должны быть в фокусе, иметь среднюю или большую капсулу и не быть чрезмерно кластеризованными.

После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как индуцировать капсулу у Cryptococcus neoformans, окрашивать ее индийскими чернилами или флуоресцентным окрашиванием, визуализировать капсулу и измерять ее с помощью автоматизированного программного обеспечения.