Метод для определения последствий экологических обогащения на биоразнообразие Микрофлора толстой кишки в мышиной модели опухоли толстой кишки

Основная цель данной публикации – представить методику нормализации микробиома грызунов. В этой демонстрации оценивается влияние обогащения окружающей среды на микробиом во время генеза опухоли толстой кишки. Этот протокол показывает, как нормализация микробиома перед вмешательством по обогащению окружающей среды улучшает экспериментальную воспроизводимость.

Мы также показываем, как снизить стресс у животных и улучшить взаимодействие с помощью обогащенной среды. Несмотря на то, что мы сосредоточились на эффекте обогащения окружающей среды в модели опухоли толстой кишки, этот метод может быть легко применен для лучшего понимания роли микробиома в этиологии заболевания. Устанавливайте клетки в стерильных условиях, работая под вентилируемым колпаком.

Контрольная группа для этого эксперимента состоит из обычных клеток с подстилкой и лабораторной тканью для гнездования, но в остальном не имеет устройств для обогащения. Чтобы установить клетки для выращивания щенков или клетки, обогащенные окружающей средой, соедините две большие автоклавные клетки стерилизованным туннелем, защищенным втулкой, и включите стерилизованную платформу в каждую клетку, чтобы увеличить площадь. Для EE также предоставьте стерилизованные беговые колеса, туннели, иглу, хижины, мячи для ползания и материал для гнезда.

Поместите обогащенные и контрольные клетки в одну и ту же стойку, чтобы обеспечить равномерную вентиляцию. Для разведения следует объединить одного производителя и двух потенциальных матерей в обычных клетках. Каждое утро проверяйте наличие вагинальных пробок, которые указывают на то, что животное спаривалось в течение ночи.

Если пробка не видна, сопротивление вагинальному зондированию может обнаружить внутреннюю пробку. Если у самки есть вагинальная пробка, пересадите ее в большую клетку для выращивания щенков. До 12 беременных самок могут быть размещены в экологически обогащенных садках с платформами, при условии, что все они должны родиться в течение одной недели.

Когда детенышам исполнится от 21 до 28 дней, распределите самцов и самок по генотипу в контрольные или обогащенные среды. Убедитесь, что в каждой клетке содержится доля каждого генотипа. Необогащенные клетки могут вместить до пяти мышей, в то время как обогащенные клетки требуют не менее 20 мышей для социальной стимуляции и могут поддерживать до 41 мыши.

Начните собирать стул за один-два дня до усыпления мышей. Всегда собирайте в одно и то же время суток. Чтобы собрать стул с живых животных, тщательно натрите животное над чистой клеткой.

Затем соберите испражненный стул с помощью стерильных щипцов и переложите в стерильную микрофуговую пробирку. Если животное не сразу испражняется, поместите его в чистую клетку и подождите, пока животное испражнится, что может занять до часа. Чтобы собрать стул у усыпленного животного, рассеките его, чтобы получить доступ к толстой кишке.

Затем разрежьте двоеточную кишку чуть ниже слепой кишки и выложите двоеточие на лист фильтровальной бумаги. Затем с помощью щипцов приподнять верхнюю часть трубки толстой кишки и открыть просвет с помощью ножниц. Разрежьте продольно дистальнее проксимального, чтобы расправить толстую кишку вдоль.

Затем соберите стул из дистального отдела толстой кишки в стерильную микрофужедную пробирку с помощью стерильных щипцов. Храните образцы кала при температуре минус 80 градусов Цельсия. Помимо стула, соберите другие образцы тканей из толстой и тонкой кишки, микросомы, жировую ткань и так далее.

Используйте коммерческий набор для выделения микробной ДНК из стула в соответствии с протоколом обнаружения патогенов в стуле. При этом перенесите образцы из морозильной камеры с температурой минус 80 градусов Цельсия на сухой лед и взвесьте их. Затем настройте ПЦР, которая амплифицирует микробную ДНК, как описано в текстовом протоколе.

Затем очистите продукты реакции с помощью магнитных шариков. Для очистки сначала кратковременно центрифугируйте ампликоновую ПЦР-планшет, чтобы объединить продукты реакции. Затем сделайте магнитные шарики вихревыми, чтобы равномерно распределить их, и перенесите по 20 микролитров аликвот в каждую реакционную лунку.

Тщательно перемешайте шарики с раствором, медленно дозируя весь объем 10 раз. Затем дайте бусинам осесть на пять минут. Затем поместите ПЦР-планшет на магнитную подставку и подождите две минуты, пока надосадочная жидкость не исчезнет после магнитного сбора шариков.

Затем удалите и выбросьте надосадочную жидкость. Далее, не снимая пластину с магнитом, наполните каждую лунку шариками 200 микролитрами свежего 80% этанола и подождите 30 секунд. Затем аккуратно удалите надосадочную жидкость.

Повторите этот шаг промывки один раз и дайте бусинам высохнуть на воздухе в течение 10 минут. Теперь вымывайте продукты реакции из шариков, сняв пластину с магнитной подставки и добавив в каждую лунку по 52,5 микролитра Триса. Полностью перемешайте шарики в растворе, медленно пипетируя весь объем 10 раз.

Затем соберите шарики на магнитной подставке как и переложите 50 микролитров надосадочной жидкости на чистую ПЦР-планшет. Накройте тарелку прозрачным клеем и храните при температуре минус 20 градусов Цельсия до одной недели. С помощью собранной надосадочной жидкости выполните индексную ПЦР для прикрепления штрих-кодов к последовательности адаптера.

Затем очистите продукты и подготовьте индексированную библиотеку для секвенирования. Известно, что у мышей обогащение окружающей среды увеличивает продолжительность жизни и заживление опухолевых ран. Чтобы определить роль микробиоты в этом фенотипе, племенные животные были интегрированы в колонию мышей в течение как минимум одного месяца для нормализации микробиоты.

Затем их разводили, а их потомство выращивали в обогащенной среде или в обычной среде. Потомство также было опухоленосным или дикого типа. Через 16 недель животных усыпляли и собирали образцы кала для выделения микробной ДНК.

Затем с помощью ПЦР была использована ПЦР для амплификации 16S рибосомальной субъединицы в образцах для изучения компонентов микробиома. Затем продукты реакции были идентифицированы с помощью индексации штрих-кодов. Интересно, что улучшенная окружающая среда не улучшает биоразнообразие диких животных, но значительно увеличивает биоразнообразие у животных-носителей опухолей.

Это демонстрирует чувствительность метода. Это увеличение биоразнообразия было связано с увеличением присутствия типа протеобактерий со значительным увеличением классов альфапротеобактерий и бетапротеобактерий и уменьшением патогенных гаммапротеобактерий. Наибольший прирост в классе бетапротеобактерий был отмечен в роде Sutterella, который, вероятно, участвует в деградации секретируемого иммуноглобулина А.

После просмотра этого видео вы должны иметь хорошее представление о том, как изменить методы ведения животноводства, чтобы нормализовать микробиом между экспериментальными животными, прежде чем приступать к интересующим вас вмешательствам. Выполняя эту процедуру, помните, что животные установили свою территорию в пределах окружающей среды. Из-за этого изменения в окружающей среде могут вызвать стресс, который повлияет на микробиом животного.

Резкое изменение в поведении животного является физическим признаком стресса. После этой процедуры можно выделить конкретные микробы и дополнительно охарактеризовать их для проверки достаточности идентифицированного микроба на прогрессирование заболевания.