Протокол изоляции моноцитарных дендритных клеток мыши и их последующее в Vitro активации с опухоли иммунных комплексов

Этот метод призван помочь ученым выделить моноцитарные ДК из крови и опухолей мышей-носителей с целью изучения их иммуностимулирующих свойств. Я считаю, что основное преимущество этой процедуры по сравнению с другими методами заключается в том, что полученные моноцитарные ДК лучше отражают состояние их активации в опухоли и крови. Самое сложное, наверное, это убедиться в том, что все ваши реактивы и инструменты стерильны и что вы не занесете загрязнение во время этой процедуры.

Я выделяю миелоидные клетки и дендритные клетки из опухолей уже более 15 лет, и идея этого метода пришла мне в голову, когда я заметил, что разные протоколы выделения приводят к разным паттернам активации клеток. Демонстрировать процедуру будет миссис Сантана-Магаль, которая является аспиранткой в моей лаборатории.

После усыпления мышей с использованием углекислого газа в ламинарном проточном колпаке извлеките опухоли и поместите их в среду RPMI без фетальной бычьей сыворотки. Затем с помощью хирургических ножниц разрежьте опухоль на мелкие кусочки. Перенесите все кусочки опухоли с одной мыши в 30-миллилитровую трубку с плоским дном, содержащую буфер HBSS, дополненный коллагеназой IV и ДНКазой I, а также магнитные стержни для перемешивания.

Инкубируйте пробирку с кусочками опухоли в шейкере при температуре 37 градусов Цельсия с магнитной мешалкой внутри со скоростью от 200 до 400 оборотов в минуту в течение 20-30 минут. Затем отфильтруйте клетки через 70-микрометровый сетчатый фильтр. Затем центрифугируйте клетки при 400-умножденной на g в течение пяти-10 минут при четырех градусах Цельсия.

После центрифугирования добавьте 1,5 миллилитров градиентного раствора среды в 8,5 миллилитров HBSS. Затем энергично перемешайте градиент плотности среды. Далее пипеткой заправляем смесь к гранулам.

Центрифугируйте клеточную суспензию при 400 умноженных на г в течение 20 минут при комнатной температуре. Сцедите надосадочную жидкость после окончания центрифугирования. После двукратной промывки гранулированных клеток повторно суспендировать в одном миллилитре изоляционного буфера.

Добавьте клеточную суспензию к 30 микролитрам CD11b сопряженных магнитных шариков. Далее выдерживаем смесь при температуре четыре градуса Цельсия в течение 15 минут. После центрифугирования удалите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу в одном миллилитре изоляционного буфера.

Нанесите клеточную суспензию на предварительно промытую магнитную колонку. Далее используйте три миллилитра изоляционного буфера, чтобы дважды промыть колонку. Затем снимите колонку с магнита.

Далее добавляем в столбец шесть миллилитров изоляционного буфера. Надавите на него с помощью поршня, чтобы вымыть магнитно помеченные клетки в стерильной пробирке для сбора. Еще раз центрифугируйте клетки при 400-умножденной на g в течение 5-10 минут при четырех градусах Цельсия.

После ресуспензии и окрашивания ячеек отсортируйте ячейки путем стробирования мелких ячеек, используя малый боковой и малый прямой разброс. После усыпления мыши распылите на нее 70% этанол. Затем с помощью хирургических ножниц удалите кожу, покрывающую сердце под ламинарным капюшоном.

Далее очистите ножницы этанолом. Промойте полость 20-миллимолярным ЭДТА HBSS, и с помощью ножниц разрежьте правое предсердие. Затем с помощью 10-миллилитрового шприца с иглой 25-го калибра медленно промывайте правый желудочек сердца 20-миллимолярным ЭДТА HBSS.

Затем с помощью стерильного шприца наберите кровь из плевральной полости. Перелейте кровь в пробирку, содержащую гепарансульфат и ЭДТА. Далее пипетку с кровью наносят на градиент плотности среды.

Центрифугируйте клетки крови при 400-кратном g в течение 15 минут при комнатной температуре с низким тормозом. После центрифугирования соберите мононуклеарные ячейки в пробирку. Растворите клетки в 10 миллилитрах изоляционного буфера, чтобы промыть клетки.

Снова центрифугируйте клетки при 400 умноженных на g в течение 5-10 минут при четырех градусах Цельсия. Чтобы выбрать клетки CD11b, ресуспендируйте клеточную гранулу в одном миллилитре изоляционного буфера. Инкубируйте в течение 15 минут с 50 микролитрами сопряженных магнитных шариков CD11b при четырех градусах Цельсия.

Повторно центрифугируйте при 400 умноженных на g в течение пяти-10 минут при четырех градусах Цельсия. Затем удалите надосадочную жидкость. Повторно суспендируйте гранулу в одном миллилитре изоляционного буфера.

Далее нанесите клеточную суспензию на предварительно промытый магнитный столбик. Дважды промойте колонку с изоляционным буфером. Снимите колонку с магнита, и добавьте на колонку шесть миллилитров изоляционного буфера.

Затем промойте меченые магнитом клетки в стерильной сборной пробирке, нажав на поршень. Центрифугируйте клетки при 400-умножденной на g в течение пяти-10 минут при четырех градусах Цельсия. Ресуспендировать клетки в изоляционном буфере и окрашивать флуорофор-конъюгированными антителами.

Отсортируйте ячейки, забив маленькие ячейки с помощью малого бокового и малого прямого рассеивания. Сначала зафиксируйте клетки в 1,8% буферизованном параформальдегиде на 10 минут при комнатной температуре. Засейте клеточную суспензию в каждую лунку U-образной 96-луночной пластины.

Затем добавьте различные разведения опухолесвязывающих антител в каждую лунку. После этого инкубируйте клетки на льду в течение 15-20 минут. После инкубации промойте клетки 150 микролитрами фосфатно-солевого буфера.

Затем центрифугируйте при 400 умноженных на g в течение пяти-10 минут при четырех градусах Цельсия. После центрифугирования изгнать надосадочную жидкость и дважды промыть клетки. Растворите клетки в 100 микролитрах буфера FACS, содержащего флуорконъюгированное вторичное антитело.

Далее выдержите тарелку на льду в течение 15 – 20 минут. Через 15-20 минут добавьте 200 микролитров буфера FACS для промывания клеток. Центрифугируйте планшет при 400-кратном пересчете на г в течение пяти-10 минут.

Сцедите надосадочную жидкость. Проведите проточную цитометрию для анализа связывания опухоли и определения минимальной концентрации иммуноглобулина G, необходимой для покрытия клеток. После того, как клетки будут покрыты минимальной концентрацией иммуноглобулина G, добавьте меченый CFSE опухолевый иммунный комплекс к дендритным клеткам, полученным из моноцитов, в соотношении один к пяти.

Затем инкубируйте смесь в течение 12-16 часов в течение ночи в полной среде. Выполните FACS-анализ активации дендритных клеток, полученных из моноцитов. Средняя интенсивность флуоресценции рассчитывается после проточного цитометрического анализа для изучения наличия антител IgG и M, которые связываются с опухолевыми клетками LMP ex vivo.

Результаты показывают, что антитела IgG от аллогенных мышей C57-Black/6 связываются с опухолевыми клетками гораздо сильнее, чем антитела от сингенных мышей 129S1. Затем рассчитывается средняя интенсивность флуоресценции способности связывания опухолевых клеток B16F10 с IgG. IgG, полученный от аллогенных мышей 129S1, демонстрирует в 10 раз более высокую интенсивность окрашивания с опухолью B16F10 по сравнению с сингенными IgG от мышей C57-Black/6.

Затем делаются микроскопические изображения DIC, чтобы показать ассоциированные с опухолью дендритные клетки, полученные из моноцитов из опухолей B16F10. Здесь получены изображения ДВС, чтобы показать воспалительные и патрулирующие дендритные клетки, полученные из моноцитов, выделенные из крови мышей с опухолями B16F10. Проточный цитометрический анализ также проводится для сравнения паттернов активации дендритных клеток, полученных из моноцитов, из селезенки и костного мозга с активацией опухоли и крови при инкубации с иммунным комплексом.

Результат показывает повышенную экспрессию CD86 и MHC II костным мозгом и дендритными клетками селезенки с иммунными комплексами. Затем проводится конфокальная иммуногистохимическая терапия, которая показывает поглощение опухоли и экспрессию MHC II, когда дендритные клетки инкубируются с меченным CFSE опухолевым иммунным комплексом. После освоения эта процедура может быть выполнена за несколько часов в зависимости от количества используемых мышей.

Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить о том, что все реагенты и инструменты всегда должны быть стерильными. Мышиный мех является основным источником загрязнений. Убедитесь, что ни один из волосков не касается ваших тканей.

Мы надеемся, что после просмотра этого видео у вас будет хорошее понимание того, как выделять моноцитарные ДК из крови и опухолей мышей и как впоследствии активировать их с помощью клеток иммунного комплекса, избегая их преждевременной активации.