С помощью человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток получены гепатоцито как клетки для обнаружения наркотиков

Общая цель этого эксперимента состоит в том, чтобы дифференцировать индуцированные плюрипотентные стволовые клетки человека в гепатоцитоподобные клетки таким образом, чтобы это было пригодно для высокопроизводительного скрининга. Клетки печени трудно вырастить в лаборатории, однако они могут быть получены из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, что обеспечивает платформу для скрининга для определения методов лечения заболеваний печени. Основное преимущество этой методики заключается в том, что неограниченное количество гепатоцитов может быть получено от любого пациента с заболеванием печени, которое повторяет болезнь в лаборатории.

Процедуру относительно легко установить, даже без обширных знаний биологии стволовых клеток. Его воспроизводимость позволяет исследователям проводить скрининг тысяч соединений без необходимости в сложной робототехнике. Рэй Лю (Ray Liu), научный сотрудник с докторской степенью, и Пейдж Лампрехт (Paige Lamprecht), аспирант, продемонстрируют эту процедуру сегодня.

Во-первых, разбавьте гибридный белок Ecad до 15 микрограммов на миллилитр фосфатно-солевым буфером Дульбекко, или DPBS, который содержит кальций и магний. Покройте 100-миллиметровую суспензию в чашки для культуры тканей пятью миллилитрами разведенной матрицы и инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия не менее одного часа. После инкубации удалите субстрат и замените его пятью миллилитрами питательной среды iPSC.

Извлеките флакон с криоконсервированными человеческими индуцированными плюрипотентными стволовыми клетками из жидкого азота. Оттаивайте при температуре 37 градусов по Цельсию, пока не останется небольшой кристалл льда. Затем аккуратно пипетируйте клетки в стерильную коническую пробирку объемом 15 миллилитров, содержащую четыре миллилитра питательной среды.

Центрифугируйте клетки при 300 G в течение пяти минут. Удалите надосадочную жидкость и осторожно восстановите суспендию клеток пятью миллилитрами среды, дополненной десятью микромолярами Y-27632, селективного ингибитора Rho-ассоциированной, содержащей спиральную спираль протеинкиназу. Теперь извлеките питательную среду из десятимиллиметровых чашек для культивирования суспензии Ecad и добавьте пять миллилитров клеток.

Как только конфлюентность iPSCs достигнет около 80%, удалите питательную среду и промойте ее DPBS, не содержащими кальция и магния. Отсадите DPBS и добавьте достаточное количество 0,02% раствора ЭДТА, чтобы покрыть посуду. Затем инкубируйте клетки до трех минут при комнатной температуре.

Как только клетки начнут высвобождаться, удалите 0,02% раствор ЭДТА и залейте чашку десятью миллилитрами М-среды, чтобы освободить клетки. Помогите отслоению ИПСК с помощью щадящего пипетирования. Перенесите 1/10 взвешенных клеток в свежую чашку для культуры тканей, покрытую Ecad, содержащую пять миллилитров М-среды.

Инкубируйте культуры при температуре 37 градусов Цельсия при 4% кислорода и 5% углекислого газа, ежедневно меняя среду. Извлеките один флакон из 250 микролитров ледяного матричного запаса с концентрацией два миллиграмма на миллилитр и разморозьте его на льду. Затем соедините размороженную матрицу с десятью миллилитрами холодного DMEM/F12, аккуратно перемешав с помощью предварительно охлажденной пипетки, чтобы получить конечную концентрацию 0,05 миллиграмма на миллилитр.

Перенесите по 100 микролитров разведенной матрицы в каждую лунку 96-луночного планшета для культуры тканей. Инкубируйте планшет при температуре 37 градусов Цельсия при 4% кислорода и 5% углекислого газа в течение не менее одного часа. После инкубации выбросьте матрицу и замените ее 50 микролитрами М среды на лунку, повторив ту же процедуру покрытия с остальными планшетами.

Теперь культивируйте ИПСК на 100-миллиметровых чашках до тех пор, пока конфлюенция клеток не достигнет 80%. Чтобы собрать ИПСК с каждой 100-миллиметровой пластины, отсадите питательную среду и промойте пятью миллилитрами DPBS. Замените полоскание тремя миллилитрами раствора для отслоения клеток, например, Аккутазы.

Затем инкубируйте около двух минут при температуре 37 градусов Цельсия при 4% кислорода и 5% углекислого газа. Как только клетки начнут отделяться, соберите урожай, добавив семь миллилитров М среды. Пипетка несколько раз, чтобы диссоциировать клеточные колонии на небольшие кластеры примерно от трех до шести клеток.

Затем соберите ИПСК в стерильную центрифужную пробирку объемом 15 миллилитров и центрифугируйте при 300 G в течение пяти минут. Когда закончите, удалите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клеточную гранулу в пяти миллилитрах М среды. Равномерно распределите клетки на 96-луночных планшетах с матричным покрытием, пипетируя 50 микролитров суспензионных клеток в каждую лунку с помощью многоканальной пипетки.

Затем культивируйте клетки в течение ночи при температуре 37 градусов Цельсия с 4% кислорода и 5% углекислого газа и повторите процедуры посева клеток с остальными планшетами. Исследуйте 96-луночные планшеты с помощью микроскопии, чтобы убедиться, что клетки покрывают не менее 70% поверхности каждой отдельной лунки. В течение первого и второго дней дифференцировки замените питательную среду 100 микролитрами среды для дифференцировки на основе RPMI на лунку.

Затем инкубируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия в кислороде окружающей среды и 5% углекислом газе в течение двух дней с ежедневной сменой среды. С третьего по пятый день дифференцировки замените питательную среду 100 микролитрами дифференцировочной среды на основе RPMI с добавлением 2% B27 и 100 нанограммами на миллилитр активного NA. Культивируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия в кислороде окружающей среды и 5% углекислом газе в течение трех дней с ежедневной сменой среды. На пятый день дифференцировки обработайте каждую лунку 100 микролитрами 0,02% раствора ЭДТА в течение 30 секунд и немедленно удалите раствор.

Добавьте 100 микролитров свежей дифференцировочной среды на основе RPMI и повторите ту же процедуру для остальных пластин. Для дифференциации между шестым и десятым днями замените питательную среду 100 микролитрами среды для дифференцировки на основе RPMI. Инкубируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия при 4% кислорода и 5% углекислого газа в течение пяти дней с ежедневной сменой среды.

Для дифференциации между днями с 11 по 15 замените питательную среду 100 микролитрами среды для дифференцировки на основе RPMI с добавлением 2% B27 и 20 нанограммов на миллилитр HGF. Инкубируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия при 4% кислорода и 5% углекислого газа в течение пяти дней с ежедневной сменой среды. Для дифференциации между 16 и 20 днями замените питательную среду средой для культивирования клеток гепатоцитов с добавлением 20 нанограмм на миллилитр онкостатина-М.

Инкубируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия в кислороде окружающей среды и 5% углекислом газе в течение пяти дней с ежедневной сменой среды. По завершении дифференцировки на 20-е сутки замените питательную среду 100 микролитрами свежей питательной среды для культивирования клеток гепатоцитов с добавлением 20 нанограмм на миллилитр онкостатина-М. После инкубации в течение 24 часов извлеките питательную среду в свежий 96-луночный планшет и храните при температуре 20 градусов Цельсия.

Повторите ту же процедуру сбора для остальных пластин. Добавьте 90 микролитров свежей питательной среды для гепатоцитов с добавлением онкостатина-М в каждую лунку 96-луночного планшета. Добавьте по десять микролитров каждого выбранного соединения из заранее приготовленного раствора рабочего состава.

Добавьте ДМСО в 0,2% в контрольные лунки для соответствия конечной концентрации в обрабатываемых образцах. После инкубации в течение 24 часов соберите питательную среду в свежую 96-луночную тарелку и храните при температуре 20 градусов Цельсия. Повторите ту же процедуру сбора для остальных пластин.

После пяти дней лечения клетки экспрессируют белки, которые характерно экспрессируются в дефинитивной энтодерме. После еще пяти дней дифференцировки энтодерма переходит в печеночную, и клетки экспрессируют FOXA2 и HNF 4a. После добавления HGF клетки экспрессируют белки, обнаруженные в фетальных гепатоцитах, и по завершении дифференцировки клетки принимают кубоидальную морфологию с ядром, содержащим выступающие ядрышки, и большую цитоплазму с множественными липидными каплями.

Иммуноокрашивание для обнаружения HNF 4a и альбумина на 20-й день дифференцировки показывает, что распределение этих белков гепатоцитов одинаково во всех лунках. iPSC были использованы для скрининга APOB-снижающих соединений, чтобы обеспечить пример использования гепатоцитов, полученных из iPSC, для скрининга малых молекул. z-фактор анализа APOB составляет 0,73, что подтверждает пригодность использования платформы для разработки лекарств.

Для каждого соединения определяли постлекарственное, долекарственное соотношение APOB. Идентификация попаданий была достигнута с помощью анализа z-оценки. Выявлено 24 потенциальных попадания с коэффициентом APOB от 0,86 до 0,44.

После исключения соединений, которые оказывали негативное влияние на жизнеспособность клеток, было обнаружено, что два соединения воспроизводимы для снижения APOB. После освоения этой техники ее можно выполнить за 25 дней, если она выполнена правильно. Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить о ежедневной подготовке свежей среды.

Неправильная концентрация компонентов из-за деградации изменит способность клеток к дифференцировке. После своего развития этот метод проложил путь исследователям в области разработки лекарств для изучения терапевтического лечения заболеваний печени с использованием индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека. После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее представление о том, как культивировать и поддерживать индуцированные плюрипотентные стволовые клетки человека, а также выполнять печеночную дифференцировку в форме с небольшой поверхностью прессования для высокопроизводительного скрининга.

Не забывайте, что работа с индуцированными плюрипотентными стволовыми клетками человека может быть чрезвычайно опасной, поэтому во время выполнения этой процедуры всегда следует надевать средства индивидуальной защиты, такие как перчатки и лабораторный халат.