Сбор и обработка лимфатических узлов от крупных животных для анализа РНК: подготовка исследований транскриптомики Лимфоузел крупных видов животных

Здравствуйте, меня зовут доктор Роберт Шаут, я ученый в Национальном центре болезней животных в Эймсе, штат Айова. В этом видеоролике JoVE мы поделимся с вами информацией о сборе и обработке лимфатических узлов у крупных животных для использования в экспериментах с последующей РНК. Например, эти эксперименты могут включать количественную ПЦР на продуктах с обратной транскрибацией или исследования секвенирования РНК транскриптомов.

Лимфатические узлы являются полезными образцами для оценки иммунных реакций хозяина, но также могут служить источником патогенной РНК для изучения, например, в случае внутриклеточных патогенов, присутствующих в иммунных клетках внутри лимфатических узлов. Образцы крупных животных, включая как домашний скот, так и дикие животные, представляют интерес для изучения зоонозных заболеваний. Здесь, в Национальном центре болезней животных, мы изучаем инфекции домашнего скота такими видами, как brucella abortus, которая вызывает бруцеллез у крупного рогатого скота и бизонов, и E.Coli O157:H7, выделяемой из кишечных путей крупного рогатого скота.

Мы также восстановим образцы тканей диких животных, таких как олени и лоси. Ряд лимфатических узлов может быть собран у животных, инфицированных различными заболеваниями. Исследования тканей у этих естественных видов хозяев, как правило, более актуальны для естественного развития болезни, чем модели мышей.

Однако процесс забора тканей у крупных видов обязательно сложнее, чем у мышей, включая более длительную задержку между эвтаназией и сбором тканей, а также больший размер лимфатических узлов. Здесь мы представим протокол выделения лимфатических узлов крупных животных для исследования РНК, который будет полезен молекулярным биологам, участвующим в транскриптомных исследованиях инфекций крупных животных, а также ветеринарным исследователям, начинающим транскриптомные исследования. В этом видео мы продемонстрируем процедуры на лимфатических узлах для крупного рогатого скота.

Перед вскрытием мы рекомендуем собрать следующие расходные материалы, специфичные для процедуры выделения тканей. Пробирки Microfuge, заполненные примерно 1 мл РНК-консерванта для тканей, такого как RNAlater, одноразовые скальпели, чистые и автоклавные щипцы, иглы для биопсии, контейнер для острых предметов для использованных скальпелей и игл, а также разделочная доска или одноразовый лоток, в зависимости от уровня инфекционности используемых материалов. В этом случае мы продемонстрируем ключевые элементы процедуры с использованием лимфатических узлов, которые мы обычно собираем у крупного рогатого скота.

Они заражены бактериями, вызывающими бруцеллез. Это прекапулярные лимфатические узлы, а также околоушные лимфатические узлы. При проведении вскрытия крупного животного для извлечения РНК полезно иметь не менее трех участников, работающих с тканями животных.

Диссектор номер один будет отвечать за секционирование крупных животных различных частей животного, диссектор номер два будет восстанавливать лимфатические узлы из разных участков животного на основном столе для вскрытия, а диссектор номер три будет работать за отдельным столом для выделения участков из каждого лимфатического узла и переноса их в пробирки с консервирующим раствором. Начнем мы с идентификации и удаления предэскулярного лимфатического узла. В идеале пальпация лимфатического узла перед рассечением поможет определить расположение лимфатического узла.

Несмотря на то, что это не всегда возможно обнаружить, преэскулярный лимфатический узел обычно прощупывается у здорового животного. Начните с того, что поместите животное в боковое лежачее положение. Вытяните плечо, переместив переднюю конечность назад на уровне колена.

Это движение вернет плечо назад и позволит легко пальпировать лимфатический узел. Нащупайте наличие лимфатического узла, как показано на рисунке. После того, как плечо будет найдено, с помощью скальпеля или ножа для вскрытия сделайте разрез кожи по контуру плеча.

Втяните кожу, чтобы показать точку мускулатуры плеча и шеи. Иногда наблюдается участок подкожного жира, особенно у чрезмерно подготовленных животных. Предэскулярный лимфатический узел часто обнаруживается с участками подкожно-жировой клетчатки.

Здесь можно увидеть три слоя кожи, мышцы и подкожный жир. Еще раз пальпируйте место расположения лимфоузла. В отличие от подкожно-жировой клетчатки, лимфатический узел при пальпации будет сохранять свою форму.

После обнаружения предэскулярного лимфатического узла тщательно рассеките подкожный жир и рассеките лимфатический узел. Появление этих лимфатических узлов у бизонов, которые мы использовали в исследованиях бруцеллеза из-за восприимчивости бизонов в районе Большого Йеллоустоуна к бруцеллам, схоже. Здесь мы демонстрируем внешний вид предэскулярного лимфатического узла, рассеченного из правого плеча американского бизона.

Далее мы перейдем к выделению околоушного лимфатического узла. Когда животное находится в боковом положении, найдите височно-нижнечелюстной сустав. С помощью скальпеля или ножа для вскрытия аккуратно сделайте надрез на коже.

Начните дорсально к суставу, и протяните вертикально вдоль линии челюсти. Рассеките кожу, чтобы обнажить подкожную клетчатку. Околоушная слюнная железа будет видна, в первую очередь, из-за ее большого размера, дольчатой поверхности и красной окраски.

С помощью щипцов и скальпеля сдвиньте околоушную слюнную железу в сторону, чтобы обнаружить, что околоушный лимфатический узел находится прямо краниально и медиально от слюнной железы. При выделении околоушного лимфатического узла крайне важно отделить ткань околоушного лимфатического узла от ткани околоушной слюнной железы. Типы тканей выглядят по-разному, в том числе и в пределах поперечного сечения ткани.

Это можно наблюдать здесь, с околоушным лимфатическим узлом слева и околоушной слюнной железой справа. Обязательно внимательно осмотрите ткань околоушных лимфатических узлов на предмет текстуры перед дальнейшей обработкой. В некоторых случаях может потребоваться иссечение околоушной слюнной железы для того, чтобы локализовать околоушный лимфатический узел.

Вот пример околоушной железы, удаленной от бычка, в которой лимфатический узел был встроен в слюнную железу и не был виден до удаления железы. Дополнительная информация об идентификации выбранных лимфатических узлов представлена в основной рукописи. После того, как лимфатические узлы будут собраны, вы готовы к удалению срезов для сохранения.

Используйте скальпель или нож для вскрытия, удалите участок лимфатического узла и сделайте сагиттальный надрез, чтобы открыть лимфатический узел. Осмотрите внутреннюю часть лимфатического узла, особенно у образцов от инфицированных животных, ища асимметрию, поражения, цветовые различия и т. д. В этом предкапулярном лимфатическом узле крупного рогатого скота невооруженным глазом видны множественные признаки.

К ним относятся фолликулы, которые являются домом для В-лимфоцитов, и глубокие корковые единицы, которые являются домом для Т-клеток. Эти причины кажутся более темными, чем медуллярные синусы, которые светлее. Здесь изображен еще один пример неинфицированного лимфатического узла.

Этот лимфатический узел принадлежит молодому бизону. Обратите внимание, что в этом примере фолликулы менее отчетливы. Для того, чтобы срезать ткани для обработки, одним из вариантов является сбор небольших кусочков тканей из каждого лимфатического узла с помощью скальпеля для последующего восстановления РНК.

Тем не менее, одной из основных проблем при сравнении профилей экспрессии между образцами является большой размер крупных лимфатических узлов животных по сравнению с лимфатическим узлом мыши, который может быть легко извлечен целиком для экстракции РНК. В результате небольшие срезы тканей не будут равномерно отражать профиль клеток в лимфатическом узле. Вместо этого, чтобы захватить клетки по профилю лимфатического узла, вырежьте из лимфатического узла клин в форме пирога, разрезанный на мелкие кусочки толщиной не более 5 мм и помещенный с помощью щипцов в пробирки, содержащие РНК.

В качестве альтернативы можно использовать методы биопсии для иссечения участков ткани из каждого лимфатического узла. Выберите инструмент для пункционной биопсии, если вы хотите собрать определенные участки, такие как определенные фолликулы из узла, а затем перенести с помощью щипцов в РНК. После того, как образцы были перенесены в RNAlater, перенесите их обратно в лабораторию и храните при температуре 4 градуса Цельсия в течение ночи, чтобы обеспечить проникновение в ткани.

После этого избавьтесь от избытка РНК и храните образцы тканей при температуре 80 градусов по Цельсию. Плюсом использования РНК-консервирующего раствора является то, что жидкий азот не требуется ни при вскрытии, ни при сборе образцов с поля. Перед получением доступа к образцам, предварительно аликвотный реагент Тризол направляется в пробирки для гомогенизации.

После того, как образцы будут извлечены из морозильной камеры, сразу же перенесите их в реагент Тризол для последующей обработки, исходя из рекомендаций производителя. Здесь кусочек 50-100 мг ткани переносится в реагент Тризол. Максимально ограничьте размораживание перед добавлением Тризола.

Хранение на сухом льду может использоваться, когда несколько образцов извлекаются из морозильной камеры для обработки. Поместите пробирки на гомогенизатор и гомогенизируйте в реагенте Тризол. Здесь используется двухминутная настройка экстракции РНК.

Когда все будет готово, проверьте наличие облачности. При необходимости повторите. Следуйте протоколу производителя для создания водных и органических слоев для каждого образца.

Удалите верхнюю прозрачную водную фазу с помощью наконечника пипетки. Переложите в новую микроцентрифужную пробирку. Далее смешайте с равным объемом 100% этанола.

Тщательно перемешиваем. Трубка часто будет казаться мутной. С помощью наконечника для микропипетки переведите жидкость в коммерческую спиновую колонку на основе диоксида кремния для дальнейшей очистки, а затем элюирования РНК.

Чтобы оценить качество РНК, загрузите один или два литра элюированного образца РНК в спектрофотометр для анализа. После завершения процедуры мы наблюдаем коэффициенты абсорбции, равные примерно двум для соотношения 260-280 и соотношения 260-230, что указывает на высокую чистоту при минимальном уносе химических веществ. Загрязнение фенолом можно наблюдать по снижению коэффициента поглощения 260-230 нм.

Во время процедуры вскрытия у таких животных, как бизоны, мы наблюдали период времени не менее 20 минут между эвтаназией и переносом первого образца ткани в консервант. Напротив, лимфатические узлы мыши могут быть удалены и сохранены после эвтаназии за считанные минуты. Поэтому нас заинтересовало определение профиля деградации лимфатических узлов с течением времени.

В основной рукописи мы также составили сводку профилей стабильности РНК в ряде других типов тканей, которые были протестированы в других публикациях. В репрезентативных экспериментах, проведенных с лимфатическими узлами бизонов, стабильность РНК была относительно постоянной в течение часа после эвтаназии. Здесь мы изображаем гелевое изображение общей РНК, очищенной из кусочков ткани надмаммарных лимфатических узлов американского бизона.

Этот вывод согласуется с предыдущими данными по другим типам тканей, собранными из литературы. Это говорит о том, что образцы приемлемого качества для последующего анализа экспрессии генов могут быть собраны даже у более сложных видов, таких как бизоны и лоси. Тем не менее, важно понимать, что более длительное время между смертью и сохранением образца может привести к изменениям в профилях экспрессии РНК, включая увеличение деградации с трех основных концов транскриптов мРНК.

Поэтому по-прежнему важно использовать быстрый, оптимизированный рабочий процесс для восстановления тканей, чтобы сократить дальнейшую задержку после того, как животное становится доступным для вскрытия, чтобы достичь наиболее биологически обоснованных профилей РНК. Кроме того, мы отмечаем, что на протяжении всей процедуры необходимо соблюдать осторожность, чтобы избежать попадания РНК-загрязнителей в образцы на протяжении всего процесса, помимо тех, которые уже присутствуют в тканях. Это включает в себя использование перчаток как части других необходимых средств индивидуальной защиты.

Мы также аликвотируем конечный продукт РНК в несколько пробирок, чтобы максимально ограничить свободное удержание образцов РНК. Например, отдельные аликвоты могут быть сохранены для использования в тестах контроля качества. Таким образом, в этом видео мы предоставили важную информацию для использования в идентификации, сборе, репрезентативном отборе проб и обработке лимфатических узлов для последующего анализа экспрессии генов.

В то время как наше репрезентативное видео было продемонстрировано на примере крупного рогатого скота и бизонов, мы также работали с лимфатическими узлами других крупных видов, включая коз и лосей. Мы надеемся, что это видео будет вам полезно в вашей работе, независимо от того, являетесь ли вы ветеринарным ученым, рассматривающим возможность использования транскриптомных методов в своей работе, или молекулярным биологом, заинтересованным в том, чтобы заняться наукой о крупных животных.