Microbiomechanical система для изучения формирования варикозной болезни и восстановления в Центральный нейрон аксоны

Общая цель этой установки с жидкостью под давлением заключается в создании повторяющихся и последовательных набуханий вдоль аксонов культивируемых нейронов. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области черепно-мозговой травмы, такие как механизмы субклеточных морфологических изменений в нейронах после травмы. Основное преимущество этого метода заключается в том, что метод производит последовательные и повторяемые морфологические изменения, которые со временем восстанавливаются.

Это очень важная методика, которую мы разработали в лаборатории. Это связано с тем, что мы можем использовать систему не только для идентификации молекулярного механизма, управляющего изменением морфологии аксонов, вызванным механическим стрессом, как новой формой нейрональной пластичности, но и использовать систему в качестве инструмента скрининга для определения новых лекарств и стратегии лечения легкой или черепно-мозговой травмы. Чтобы начать эту процедуру, поместите одну или несколько коробок с 12-миллиметровыми или 25-миллиметровыми покровными стеклами в стеклянный стакан, содержащий 70% азотной кислоты, и инкубируйте их при комнатной температуре в течение ночи.

На следующий день переложите все покровные стекла в четырехлитровый стакан, наполненный 2,5 литрами дважды дистиллированной воды. Встряхивайте стакан с покровными стеклами в течение часа со скоростью 100 оборотов в минуту и не забывайте использовать резиновые ленты для удержания стакана во время встряхивания. Затем переложите очищенные покровные листы в сухую колбу с металлической крышкой.

Выпекайте покровные стекла в духовке при температуре 225 градусов Цельсия в течение шести часов. Затем дайте им остыть до комнатной температуры и храните в стерилизованном пластиковом контейнере до использования. Теперь поместите по одному покровному стеклу в каждую лунку 24-луночной пластины.

Добавьте 30 микролитров раствора для покрытия покровного стекла на 12-миллиметровый покровный лист и закрутите. После этого добавьте по одному миллилитру стерильного PBS в каждую лунку. Планшет можно использовать сразу или хранить при температуре четыре градуса Цельсия в стерильном PBS до одной недели.

В день вскрытия извлеките ПБС из тарелки. Высушите на воздухе и поместите пластину под ультрафиолетовый свет на два-четыре часа. Чтобы диссоциировать нейроны гиппокампа для культивирования, разморозьте раствор фермента протеазы и предварительно нагрейте плоскую среду до 37 градусов Цельсия.

Далее промойте рассеченный гиппокамп с помощью SLDS. Затем удалите его, добавьте два миллилитра раствора фермента протеазы и инкубируйте образец при температуре 37 градусов Цельсия в течение 15 минут. После этого дважды промойте экспланты гиппокампа пятью-10 миллилитрами плоской среды и добавьте пять миллилитров плоской среды.

Диссоциируйте экспланты гиппокампа на отдельные клетки, создав небольшой вихрь с помощью пипетки с пластиковым наконечником объемом в один миллилитр. Проводите пипеткой вверх и вниз около 40 раз, избегая образования пузырьков кислорода, пока раствор не помутнеет и не останется крупных кусков экспланта. Затем центрифугируйте ячейки при 1,125-кратном течении силы тяжести в течение трех минут.

Удалите надосадочную жидкость вместе с погруженными в среду клетками и повторно суспендируйте клетки в 145 миллилитрах гальванической среды. Затем добавьте один миллилитр клеточной суспензии на лунку в 24-луночный планшет. Инкубируйте клетки в гальванической среде при температуре 37 градусов Цельсия в течение двух-четырех часов.

После этого удалите гальванический материал и замените его свежим средством для технического обслуживания. Через два дня замените половину среды двумя микромолярными РСК, растворенными в поддерживающей среде, чтобы подавить рост фибробластов, эндотелиальных и глиальных клеток. Затем, после воздействия на клетки RSC в течение двух суток, замените среду на свежую поддерживающую среду.

Для трансфекта для визуализации морфологии клетки разведите конструкцию из подвойя в концентрации один микрограмм на микролитр в среде и вихре Opti-MEM. Затем разведите липосом-опосредованный реагент для трансфекции в среде и вихре Opti-MEM. Впоследствии приготовьте по одному строительному разведению и по одному трансфекционному разведению для каждой лунки.

Затем приготовьте смесь «один к одному» из конструкта и реагента среды и трансфекции Opti-MEM и среды и вихря Opti-MEM. Выдержать смесь при комнатной температуре в течение 20 минут. Через 20 минут удалите половину среды из каждой лунки и переложите эту среду в чистую коническую трубку.

Держите трубку в инкубаторе, затем добавьте 100 микролитров приготовленной на предыдущем этапе смеси в оставшуюся среду в лунке. Дайте клеткам инкубироваться при температуре 37 градусов Цельсия в течение 20-30 минут. Во время инкубации добавьте один объем свежей поддерживающей среды в среду в конической трубке и поместите смесь в тот же инкубатор.

После инкубации удалите из лунок среды, содержащие раствор для трансфекции, и замените их смесью старой и свежей среды в конической трубке в соотношении один к одному. При этой процедуре пипетку вставляют в завинчивающуюся верхнюю часть микроманипулятора, чтобы удерживать ее на месте. Прикрутите металлический винт с плоским верхом, прикрепленный к руке микроманипулятора, так, чтобы он удерживал невытянутый конец пипетки чуть выше места крепления резиновой трубки.

Наклоните пипетку под углом 45 градусов к поверхности нейрона, содержащей покровные стекла. Включите фильтр для флуоресценции. Откройте диафрагму и убедитесь, что через объектив видно флуоресцентное пятно.

С помощью микроманипулятора переместите пипетку в положение, которое совмещает наконечник с флуоресцентным пятном, и опустите пипетку в положение, расположенное чуть выше высоты чашки для культивирования клеток. Как только он окажется на месте, включите проходящий свет и выключите цветение. С помощью пинцета перенесите одну защитную пленку клетками к пипетке с планшета для клеточной культуры на чашку для клеточных культур, содержащую 2 миллилитра буфера Хэнка при комнатной температуре.

Используя ручку точной фокусировки и 20-кратный объектив, сфокусируйтесь на плоскости, находящейся примерно на четыре полных оборота над ячейками. Затем с помощью микроманипулятора расположите наконечник пипетки так, чтобы он был сфокусирован и находился в центре левой стороны плоскости, если смотреть через окуляры. Как только пипетка будет на месте, сфокусируйте микроскоп на плоскости, содержащей интересующую область.

При визуализации семи делений трансфицированные GFP нейроны гиппокампа мышей показали аксоны до и после отечности, а также последующий 10-минутный период восстановления. Вот кимограф покадровой визуализации того же нейрона. Красными стрелками обозначены варикозные расширения, которые сформировались в течение следующих 150 секунд 190 миллилитров H2O, начиная с 30 секунд.

После освоения этой техники ее можно сделать за три часа, если она выполнена правильно. После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как запись всей клетки, покадровая визуализация FRET и TIRF, а также визуализация кальция, чтобы ответить на дополнительные вопросы, такие как влияние механического стресса на нейронную, электрическую и кальциевую сигнализацию, транспорт белков и взаимодействия. После своего развития этот метод проложил путь исследователям фоточерепно-мозговой травмы, чтобы объяснить молекулярные механизмы, лежащие в основе формирования аксонального варикозного расширения вен в живых нейронах.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как проводить эксперименты по изучению механоощущений центральных нейронов.