Метод для измерения функции слюнной железы у мышей

Общая цель этой процедуры заключается в точном и воспроизводимом сборе и измерении слюны мыши после стимуляции пилокарпином. Измерение выработки слюны у грызунов является сложной процедурой и подвержена высокой изменчивости. Этот метод прост и может быть повторен на одном и том же животном в нескольких временных точках всего исследования.

Этот метод позволяет не только измерить объем производимой слюны, но и может быть использован для сбора слюны для дальнейшего анализа биоактивных молекул, которые могут выделяться в слюне. В конечном счете, это будет очень полезно при исследовании синдрома Шегрена, фиброза слюнных желез или регенерации слюнных желез в модельных системах грызунов. Для этой процедуры необходимо подготовить и заморозить аликвоты гидрохлорида пилокарпина не старше трех месяцев.

Не замораживайте повторно размороженные аликвоты. Начните с подготовки микропробирок объемом 0,6 мл. Осторожно проделайте небольшое отверстие в дне трубок нагретой иглой 18 калибра.

Сделайте по одной трубке на каждую мышь. Затем установите эти пробирки в пробирки объемом 2 мл. Стерильность не является проблемой.

Далее, используя асептические методы, разрежьте цилиндрические абсорбирующие тампоны на два сантиметра длины. Затем отрежьте каждый двухсантиметровый кусок по диагонали, чтобы получилось два тампона конической формы. Поместите по одному коническому тампону в каждую из подготовленных микропробирок.

Затем взвесьте каждую пробирку объемом 0,6 мл сухим тампоном. Теперь перенесите мышей для исследования в новую чистую клетку. Они могут размещаться вместе.

В течение следующих двух часов давайте им ледяную воду, но не кормите. Непосредственно перед окончанием двухчасового периода приготовьте рабочий раствор пилокарпина, разбавив аликвоту 100x бульона в стерильном физиологическом растворе до 1x. Закрутите трубку и держите раствор на льду.

Для начала взвесьте каждую мышь, чтобы рассчитать дозы. Затем обезболите мышей внутрибрюшинными инъекциями кетамина и ксилазина. Если через четыре минуты мышь не обезболилась, то скорректируйте дозировку.

Теперь нанесите талмическую мазь на оба глаза, чтобы предотвратить высыхание. Далее подайте рассчитанную дозу пилокарпина мыши с помощью внутрибрюшинного пути, и установите таймер на две минуты. В течение этого двухминутного интервала вставьте мышь в ограничительную трубку объемом 50 мл, чтобы торчали только голова и уши.

Расположите трубку под углом 45 градусов так, чтобы голова мыши была опущена, а брюшная поверхность была обращена вверх. Затем закрепите трубку скотчем. По прошествии двух минут поднимите нижнюю челюсть, чтобы открыть рот, и осторожно введите закрытые рассекающие щипцы на один-два миллиметра в рот.

Убедитесь, что язык упирается в верхнюю руку щипцов. Другой рукой используйте пару тонких щипцов, чтобы удерживать предварительно взвешенный сухой тампон близко к его коническому кончику. Затем осторожно вставьте конический кончик тампона в рот и извлеките щипцы, оставив кончик тампона в ротовой полости.

Теперь возьмитесь за руку и поворачивайте тампон до тех пор, пока он не будет максимально соприкасаться со ртом, и так, чтобы он не выпал. Широкий конец тампона должен оставаться за пределами рта. Держите тампон в таком положении в течение пятнадцати минут.

Через пятнадцать минут осторожно поверните тампон, чтобы собрать слюну, которая не была впитана. Затем переложите смоченный слюной тампон в микропробирку объемом 0,6 мл. Закройте тюбик крышкой и установите его в пробирку объемом 2 мл, помещенную на лед.

Теперь перенесите мышь обратно в каркас для восстановления. Положите в клетку диетический гель или увлажненные гранулы пищи, чтобы помочь ребенку восстановить водный баланс. Подкожная инъекция 0,2 мл изотонического раствора также может быть введена для ускорения выздоровления.

Собрав все образцы слюны, взвесьте их, чтобы определить массу собранной слюны. Отрежьте крышки от пробирок объемом 2 мл, содержащих меньшую пробирку с образцом слюны, а затем загрузите их в охлаждаемую центрифугу и вращайте в течение двух минут при температуре 7500 г и четырех градусах Цельсия. Слюна будет собираться в двух мл трубки.

Затем измерьте объемы образцов с помощью микропипетки. Производство слюны измеряли у одиннадцатинедельных черных мышей C57 и шести самок с использованием описанного метода. При дозе 1 микрограмм пилокарпина на грамм массы тела у некоторых мышей начали проявляться признаки дистресса.

Наблюдалась хорошая корреляция между пилокарпином и выработкой слюны. Также наблюдалось значительное соответствие между весом и объемом слюны. С помощью описанной методики были обнаружены различия между деформациями в слюне.

Мышиный штамм 129 S6 производил наименьшее количество слюны. В эксперименте по выявлению гипофункции слюнных желез были введены липополисахариды для активации врожденного иммунного ответа. Во время ответа у мышей вырабатывалось меньше слюны.

Другой тактикой для стимуляции гипофункции слюнных желез было введение мышам адъюванта Alum плюс антитела против Ro52. Управление транспортным средством обрабатывалось только квасцами. Это также можно было обнаружить с помощью описанного метода.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как точно и воспроизводимо измерить выработку слюны у мышей. После освоения десять мышей можно оценить примерно за два с половиной часа. Пытаясь пройти эту процедуру, важно помнить о предельно последовательности на каждом этапе, начиная с внутрибрюшинных инъекций и заканчивая установкой тампона, а также с учетом временных интервалов для каждого этапа.

Не стоит забывать, что пилокарпина гидрохлорид действует на сердечно-сосудистую систему, вызывая брадикардию и гипотонию. Поэтому инъекции пилокарпина мышам следует проводить с осторожностью.