Сверхчувствительная обнаружения биомаркеров с помощью молекулярного импринтинга основе емкостной биосенсор

Общая цель этого метода заключается в обнаружении и количественном определении малораспространенных биомолекул в очень сложных образцах с высокой чувствительностью, простотой, низкой стоимостью, скоростью и без использования какой-либо маркировки. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области биотехнологии, биохимии и биомедицины, такие как мониторинг окружающей среды, безопасность пищевых продуктов, качество питьевой воды и медицинская диагностика. Основными преимуществами этого метода являются присущая ему быстрота, простота, высокая чувствительность, низкая стоимость, легкость манипуляций и обнаружение в режиме реального времени без использования каких-либо реагентов для маркировки.

Применение этого метода распространяется и на диагностику заболеваний благодаря его способности количественно определять малораспространенные биомолекулы. Например, разные биомаркеры в режиме реального времени. Чтобы очистить стеклянные покровные стекла, погрузите их в 10 миллилитров 1,0 моляра HCl на 10 минут в ультразвуковой очиститель комнатной температуры.

Затем погрузите их в деионизированную воду и гидроксид натрия 1,0 моляра в тех же условиях. Просушите стеклянные покровные стекла газообразным азотом. Затем погрузите чистые и высушенные покровные стекла в 10 миллилитров раствора APTES на один час для введения аминогрупп на поверхность покровного стекла при комнатной температуре.

Промойте покровные стекла деионизированной водой, прежде чем снова высушить их газообразным азотом. Погрузите модифицированные покровные стекла APTES в 10-миллилитровый раствор глутаральдегида на два часа для активации аминогрупп на поверхности при комнатной температуре. После инкубации промойте покровные стекла 10 миллимолярным фосфатным буфером, чтобы удалить избыток глутаральдегида с поверхности.

Просушите покровные стекла газообразным азотом. Далее приготовьте 1,0 миллилитра раствора в 10 миллимолярном фосфатном буфере в концентрации 0,1 миллиграмма на миллилитр. Капните 200 микролитров этого шаблонного раствора на модифицированные покровные стекла и инкубируйте при температуре четыре градуса Цельсия в течение ночи.

Чтобы очистить электроды, сначала погрузите электроды в небольшую мензурку, содержащую пять миллилитров 70%-ного этанола, на 10 минут в ультразвуковой очиститель комнатной температуры. Затем последовательно погрузите электроды в деионизированную воду, ацетон, деионизированную воду, кислый раствор пираньи и деионизированную воду в тех же условиях. Высушите электроды газообразным азотом.

Для проведения электрополимеризации Тирамина необходимо приготовить восемь миллилитров 10 миллимолярного раствора Тирамина в 10 миллимолярном фосфатном буфере, содержащем два миллилитра этанола. Выполните 15 циклов циклического вольтамперометрического сканирования в этом решении с помощью потенциостата, охватывающего диапазон потенциалов от нуля до 1,5 вольт и скорость сканирования 50 милливольт в секунду. Затем промойте электроды деионизированной водой, прежде чем высушить электроды газообразным азотом.

Погрузите электроды в раствор, содержащий 30 миллимоляров акрилоилхлорида и 30 миллимолярных триметиламинов в толуоле при комнатной температуре, на ночь перед тем, как снова промыть и высушить электроды. Перед полимеризацией приготовьте монимерный раствор, содержащий мономеры и сшивающий агент в 820 микролитрах сверхчистой воды. Затем приготовьте 5% объема TEMED в ультрачистой воде.

Добавьте в раствор мономера 20 микролитров раствора TEMED, и продуйте газообразным азотом в течение пяти минут. Затем добавьте в раствор мономера 20 микролитров свежеприготовленной АФС. Пипеткой нанесите 1,5 микролитра раствора мономера на поверхность модифицированного золотого электрода.

Теперь начните полимеризацию, приведя штамп шаблона в контакт с обработанной мономером поверхностью, и оставьте его на пять часов при комнатной температуре. После полимеризации удалите штамп шаблона с поверхности аккуратно, с помощью щипцов. Далее промойте электрод деионизированной водой и высушите газообразным азотом.

Погрузите электроды в один миллилитр десяти миллумеров одного додеканетеола, приготовленного в этаноле, на двадцать минут, чтобы закрыть точечные отверстия на поверхности электрода. Наконец, промойте электроды деионизированной водой и высушите электроды газообразным азотом, прежде чем охарактеризовать их поверхности с помощью сканирующей электронной микроскопии. Вставьте впечатанные емкостные золотые электроды в электрохимическую проточную ячейку, интегрированную в емкостный биосенсор.

Приготовьте 100 миллилитров регенерационного буфера и один литр бегущего буфера. Начните анализ с инъекции буфера регенерации для регенерации системы и запуска буфера для восстановления баланса системы в течение 25 минут. Приготовьте стандартные шаблонные растворы в нужном диапазоне концентраций в рабочем буфере.

Затем последовательно введите 250 микролитров этих стандартных растворов в систему в оптимальных условиях. Определение характеристик поверхности золотых электродов выполняется методом сканирующей электронной микроскопии. Показана голая золотая поверхность.

Также показаны бактериофаги, прилипшие к поверхности электрода в различных увеличениях. Здесь показано связывание бактериофага с впечатленным золотым электродом в режиме реального времени с помощью сензограммы. Стабильный исходный уровень устанавливается после регенерации и восстановления равновесия системы перед введением образца.

На электроде имеются фагоспецифичные полости. Введение бактериофагов, индуцирующих образец, приводит к снижению емкости за счет связывания бактериофагов-мишеней с отпечатанными полостями на поверхности золотых электродов. Калибровочные кривые показывают изменение емкости в зависимости от впрыска белка при введении бактериофага.

Из уравнений на этих графиках можно рассчитать концентрацию бактериофага или белка в образце. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как разработать сверхчувствительную, быструю систему обнаружения в режиме реального времени. После освоения этой техники ее можно выполнить за пять часов и тридцать минут, не считая времени ожидания между ними.

При попытке выполнить эту процедуру, важно подготовить все средства свежими, в один и тот же день. После этой процедуры могут быть выполнены другие метрики, такие как атомно-силовая микроскопия, сканирующая электронная микроскопия, эллипсометр и измерения квантовых углов, чтобы определить, была ли полимеризация или импринтинг успешной, и обнаружить любую значительную разницу между поверхностями голых и впечатанных золотых электродов. После своего развития этот метод проложил путь исследователям в области биохимии, биотехнологии и биомедицины к изучению сверхчувствительного обнаружения биомолекулы в области безопасности пищевых продуктов и медицинской диагностики.

Не стоит забывать, что работа с функциональными мономерами, сшивающими агентами, инициаторами и другими агентами может быть крайне опасной. Кроме того, при проведении этих экспериментов всегда следует соблюдать меры предосторожности, такие как ношение перчаток, лабораторных халатов и проведение экспериментов по полимеризации внутри вытяжного шкафа.