Трансплантация стволовых клеток жировой ткани производные листа для уменьшения утечки после частичное колэктомия в мышиной модели

Поскольку они предполагают положительное влияние на заживление тканей, листы ASC были проверены на многих моделях заболеваний, таких как инфаркт миокарда. Этот эксперимент показывает, что листы ASC можно использовать внутрибрюшно и наносить на кишечник. Главное преимущество листов ASC заключается в том, что не нужны синтетические материалы.

Кроме того, пересадку листа ASC относительно легко выполнить, потребовав лишь небольшого количества практики. Это новое применение трансплантации листа ASC было разработано для предотвращения утечки после резекции кишечника и является первым шагом к новой терапевтической стратегии. Было показано, что листы ASC, применяемые к кишечному анастомозу, являются многообещающими в предотвращении утечки.

Листы ASC также могут быть наложены на другие внутрибрюшные органы, такие как мочевыводящие пути. Начните с рассечения подкожной абдоминальной жировой ткани человека на кусочки по 0,5 см с помощью стерильного хирургического лезвия размера 10, тканевых щипцов Adson-Brown и ножниц Метценбаума. Взвесьте общее количество рассеченной ткани в стерильной стеклянной бутылке.

Добавьте 30 мл изоляционной среды на каждый флакон. И переварите рассеченную жировую ткань в шейкере-инкубаторе при 150 оборотах в минуту и 37 градусах Цельсия в течение одного часа. Через час разделите переваренный тканевый раствор на пробирки объемом 50 мл, и центрифугируйте пробирки в течение 10 минут при 390 G. После центрифугирования удалите надосадочную жидкость.

Добавьте среду для ресуспендирования клеточных гранул и добавьте еще питательную среду, до 45 мл. Центрифугируйте объединенные клетки в течение пяти минут при 390 G и удалите надосадочную жидкость. Ресуспендируйте клеточную гранулу 10 мл питательной среды.

И фильтруем клеточную суспензию через фильтр 100 микрон. Добавьте 50 л 3%-ного раствора кислотной кислоты метиленового синего, к 50 л клеточной суспензии, к эритроцитам вшей. После смешивания раствора нанесите пипеткой 10 л на гемоцитометр, и подсчитайте клетки.

Поместите клетки с плотностью 40000 клеток на квадратный см в колбу T175, содержащую питательную среду. И инкубируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия во влажной атмосфере с 5% CO2 в течение 24 часов. На следующий день промойте клетки теплым фосфатным буферным раствором, чтобы удалить клеточный мусор.

Затем замените среду 10% питательной средой FBS, а также свежедобавленным аскорбиновой кислотой-2-фосфатом и фактором роста человеческого рекомбинантного фибробласта два. Инкубируйте до тех пор, пока клетки не достигнут 90% конфлюенции. Субкультивируют жировые стволовые клетки при 90% конфлюенции, используя стандартный 0,25% раствор трипсина-ЭДТА.

Через три-пять минут нейтрализовать 0,25%-ный раствор Трипсина-ЭДТА 10 мл питательной среды. Переложите в центрифужную пробирку и центрифугируйте клетки в течение восьми минут при температуре 250 G. Удалите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клетки в 1 мл питательной среды. После подсчета клеток с помощью гемоцитометра поместите клетки в колбы для культур Т175 с плотностью 8000 клеток на квадратный см.

Оставшиеся АСК заморозить в жидком азоте с 10% диметилсульфоксидом в питательной среде перед дальнейшим использованием. Покройте термочувствительные питательные посуды диаметром 3,5 см, с 1 мл фетальной бычьей сыворотки. Затем поместите посуду в инкубатор при температуре 37 градусов Цельсия, минимум за 30 минут до посева.

Чтобы помочь адгезии ASC к термочувствительной чашке и снизить риск преждевременного отслоения листа ASC в культуре, термочувствительная чашка должна быть предварительно покрыта сывороткой плода крупного рогатого скота перед посевом клеток. Трипсинизируйте ASC так же, как и раньше, если после трипсинизации есть какие-либо скопления клеток, перед подсчетом отфильтруйте клетки через фильтр 100 микрон. Выньте посуду из инкубатора, и переложите в согревающую тарелку при температуре 37 градусов Цельсия.

Удалите FBS из чашки. После суспендирования клеточной гранулы в LG DMEM, с 10% FBS, и подсчета клеток, разведите в 3,52 раза по 10-6 ASC в 2 мл питательной среды на чашку, чтобы засеять 400000 клеток на квадратный см в каждой чашке размером 3,5 см. Аккуратно распределите ячейки как можно равномернее, аккуратно раскачивая посуду.

Затем культивируйте листы ASC в течение 48 часов при температуре 37 градусов Цельсия во влажной атмосфере с 5% CO2. В день пересадки дайте посуде для культуры остыть до комнатной температуры за 40 минут до пересадки in vivo, чтобы облегчить отслоение листа ASC. После охлаждения удалите питательную среду и замените ее 1 мл бессывороточного LG DMEM.

Чтобы пересадить клеточный лист, аккуратно возьмитесь за край листа ASC атравматичными щипцами и поместите сторону чашки листа ASC поверх линии анастомоза. Бережное обращение с листом и правильное размещение листа имеют важное значение для обеспечения успешной пересадки неповрежденного листа. Аккуратно растяните лист ASC примерно на 0,25 см выше и ниже линии анастомоза.

Оберните лист вокруг толстой кишки, приподнимая толстую кишку, чтобы обернуть лист ASC вокруг тыльной стороны. У контрольных животных, не получавших трансплантированных листов ASC, на третий день после операции наблюдалась утечка кала вблизи анастомотической линии, обозначенная белой стрелкой. У животных с трансплантированными листами ASC, обозначенными черной стрелкой, наблюдалось снижение утечки кала и образование абсцесса на третий день после операции.

Такой же результат наблюдался через семь дней после операции. На этом изображении показан репрезентативный срез участка колоректального анастомоза у трансплантированного животного, окрашенного H и E. Структура листа может быть идентифицирована в месте анастомоза в течение семи дней после операции. После освоения этой техники ее можно сделать за несколько минут, если она выполнена правильно.

Лист ASC будет самопроизвольно прилегать к поверхности толстой кишки с нулевыми ячейками, нет необходимости использовать клей или шов, чтобы подогнать лист ASC. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как подготовить и пересадить листы ASC на колоректальный анастомоз у крыс, для предотвращения утечки после частичной колэктомии.