Поколение и изоляции арестован клеточного цикла клетки с сложных получен
13 апреля 2018 г.
Анеуплоидия приводит к нестабильности генома, который в конечном итоге производит арестован клеточного цикла клетки с сложными получен. Этот документ предоставляет простой и удобный метод для изоляции анеуплоидных клеток с сложных получен, которые перестают разделить.
Общая цель этого протокола состоит в том, чтобы предоставить простой метод генерации и изоляции клеток, остановленных клеточным циклом, со сложными кариотипами. Этот метод может дать ответы на ключевые вопросы в области исследования анеуплоидии, такие как взаимодействие иммунной системы с анеуплоидными клетками. Основное преимущество этого метода заключается в том, что он генерирует популяцию клеток, которая содержит только сложные кариотипы.
Чтобы начать синхронизацию клеток RPE-1 hTERT, используйте только что размороженные клетки и распределите их в 10-сантиметровую чашку для культуры тканей, используя восемь миллилитров стандартной питательной среды. Далее с помощью гемоцитометра определяют номер клетки. Затем инкубируйте клетки на ночь.
На следующий день замените стандартную питательную среду на среду, содержащую пять миллимоляров тимидина. Инкубируйте в течение 24 часов при температуре 37 градусов Цельсия для синхронизации клеток на границе G1S. Через 24 часа трижды промыть клетки PBS.
Затем добавьте стандартную питательную среду в промытые клетки и инкубируйте в течение шести часов при температуре 37 градусов Цельсия. Для начала промойте клетки 10 миллилитрами PBS. Затем добавьте среду, содержащую 500 наномолярных ингибиторов Mps1 реверсина.
Выдерживать в течение 12 часов при температуре 37 градусов Цельсия. На следующий день трижды промыть клетки с помощью PBS. Затем добавьте стандартную питательную среду и верните пластины в инкубатор.
Примерно через 72 часа после первого аберрантного митоза промойте клетки 10 миллилитрами PBS. Затем добавьте среду, содержащую 330 наномолярного нокодазола. Выдерживать в течение 12 часов при температуре 37 градусов Цельсия.
На следующий день аспирируйте нокодазол медиумом. Затем добавьте в блюдо три миллилитра PBS и постучите по краю тарелки, чтобы стряхнуть митотические клетки. Поворачивайте пластину между каждым нажатием, чтобы обеспечить равномерное удаление митотических клеток.
После первоначального оттряхивания аспирируйте любую жидкость, прилипшую к крышке и краю пластины. Затем проверьте пластину под микроскопом при 10-кратном увеличении. Затем промойте клетки пятью миллилитрами PBS.
Далее добавьте среду, содержащую 330 наномолярный нокодазол. Выдерживать в течение 12 часов при температуре 37 градусов Цельсия. После окончательного оттряхивания добавьте 10 миллилитров стандартной питательной среды.
Инкубируйте клетки в течение 12-24 часов при температуре 37 градусов Цельсия перед проведением анализов. Оставшиеся на пластине клетки называются арестованными со сложным кариотипом или клетками ArCK. Этот протокол описывает простой метод выделения клеток ArCK, и для подтверждения их выделения анализируются некоторые особенности, специфичные для клеток ArCK.
Клетки ArCK демонстрируют повышенный уровень ингибиторов клеточного цикла p53, p21 и p16 в иммуноблоттинге, в то время как эуплоидные и анеуплоидные циклические клетки этого не делают. Кроме того, клетки ArCK позитивны на бета-галактозидазу, связанную со старением, которая окрашивает в сине-зеленый цвет, в то время как эуплоидные контрольные клетки - нет. Графики сегментации показывают, что клетки ArCK являются анеуплоидными, характеризующимися множественными, случайными приростами хромосом и потерями хромосом.
Сегментационные графики показывают количество копий одиночных клеток от хромосомы 1 до X, относительно эуплоидной шкалы референса log two. Пытаясь выполнить эту процедуру, важно убедиться, что вы удаляете все митотические клетки во время каждого встряхивания. После выполнения этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как анализ на цитокины.
Эти анализы помогут ответить на дополнительные вопросы, такие как способность клеток ArCK взаимодействовать с клетками иммунной системы. Не забывайте, что нокодазол опасен. Во время использования данного реагента следует надевать соответствующие средства индивидуальной защиты.
После освоения эта техника может быть использована для эффективной изоляции клеток ArCK in vitro. Эту процедуру можно провести за семь дней при правильном выполнении.
Обзор
В данном исследовании представлен простой метод выделения анеуплоидных клеток со сложными кариотипами, заблокированных в клеточном цикле. Данный метод направлен на более глубокое понимание анеуплоидии и ее влияния на поведение клеток и иммунные взаимодействия.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Клеточная биология
- Генетика
- Нейробиология
Теоретическая база
- Анеуплоидия связана с нестабильностью генома.
- Клетки со сложными кариотипами часто перестают делиться.
- Изучение таких клеток может дать представление о раке и других заболеваниях.
- Изоляция этих клеток может способствовать дальнейшему исследованию их свойств.
Цель исследования
- Разработать метод получения и выделения клеток с остановленным клеточным циклом.
- Изучить характеристики анеуплоидных клеток.
- Исследовать взаимодействие между анеуплоидными клетками и иммунной системой.
Используемые методы
- Синхронизация клеток RPE-1 hTERT с использованием тимидина и нокодазола.
- Метод встряхивания клеток для изоляции митотических клеток.
- Иммуноблот-анализ для оценки ингибиторов клеточного цикла.
- Окрашивание на ассоциированную со старением бета-галактозидазу для идентификации клеток ArCK.
Основные результаты
- В клетках ArCK наблюдается повышенный уровень ингибиторов клеточного цикла.
- Эти клетки положительны по маркерам старения.
- Графики сегментации подтверждают наличие анеуплоидии в изолированных клетках.
- Данный метод эффективно изолирует клетки со сложными кариотипами.
Выводы
- Данный протокол представляет собой надежный способ изучения анеуплоидных клеток.
- Изолированные клетки ArCK могут быть использованы для дальнейших исследований иммунных взаимодействий.
- Правильное выполнение метода позволяет получить результаты в течение недели.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Изоляция клеток с остановленным клеточным циклом и сложным кариотипом позволяет механистически снизить риски при изучении фенотипов, вызванных анеуплоидией, в рамках поисковых биологических исследований. Данный подход способствует валидации мишеней, обеспечивая воспроизводимую систему для изучения хромосомной нестабильности и ее влияния на клеточное старение, воспаление и иммунные взаимодействия. Использование в методе стандартных методов культивирования тканей повышает масштабируемость и возможность кросс-функционального внедрения в конвейеры НИОКР на ранних стадиях.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичное обнаружение и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы, связывающие анеуплоидию с нестабильностью генома и про-воспалительными фенотипами.
- Практическая ценность: предоставляет стандартизированный недорогой рабочий процесс для получения клеток ArCK с использованием синхронизации тимидином, реверзином и нокодазолом.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: Позволяет получить определенную популяцию клеток со сложным кариотипом для количественного анализа маркеров старения и секреции цитокинов.
- Практическая ценность: Обеспечивает стандартизацию анализа за счет стабильного выделения клеток с остановленным циклом путем встряхивания и обработки нокодазолом.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: упрощает изучение взаимодействий анеуплоидных клеток с иммунными клетками, что позволяет оценивать иммуномодулирующие мишени.
- Практическая ценность: позволяет проводить последующие функциональные анализы, такие как профилирование цитокинов и окрашивание на ассоциированную со старением бета-галактозидазу, для подтверждения фенотипических результатов.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод вписывается в континуум исследований — от проверки гипотез о конкретных мишенях до фенотипического скрининга, особенно для механизмов, связанных с хромосомной нестабильностью и путями ответа на стресс.
- Биология открытий: способствует снижению механистических рисков путем изоляции клеток с определенной кариотипической сложностью для выяснения причинно-следственных связей между анеуплоидией и клеточными фенотипами.
- Скрининг: позволяет воспроизводимо подготавливать клетки ArCK для высококонтентного анализа ингибиторов клеточного цикла и секреторных профилей.
- Аналитика: обеспечивает получение количественных данных, включая иммуноблот-детекцию p53, p21, p16 и графики сегментации вариации числа копий в отдельных клетках.
- Трансляционные исследования: связаны с исследованиями иммунных взаимодействий, поддерживая поиск биомаркеров в секреторных фенотипах, ассоциированных со старением.
- Корпоративное повторное использование: предполагает использование доступных реагентов и стандартного оборудования для культивирования, что позволяет адаптировать методику в различных лабораториях без специализированной инфраструктуры.
Операционное и корпоративное влияние
- Научная ценность: Снижает механистическую неоднозначность в исследованиях анеуплоидии, предоставляя определенную модель ареста с комплексными кариотипами.
- Операционная ценность: Предлагает семидневный протокол с высокой специфичностью для клеток ArCK, что повышает пропускную способность и воспроизводимость.
- Стратегическая ценность: Обосновывает решения о целесообразности дальнейшей разработки (go/no-go), позволяя проводить раннюю оценку биологических рисков, обусловленных анеуплоидией в целевых путях.
- Влияние на портфель: Поддерживает приоритизацию мишеней, связанных с хромосомной нестабильностью и старением, с учетом оценки рисков.
Особенности реализации
- Требуется опыт применения методов синхронизации клеток и процедур митотического «оттряса» (shake-off).
- Необходимо наличие стандартных инкубаторов для культивирования тканей, гемоцитометров, а также флуоресцентного или светлопольного микроскопа для валидации.
- Требуется стандартизация работы с нокодазолом и этапов промывки для обеспечения полного удаления митотических клеток во всех повторностях.
- Адаптация метода для других клеточных линий может потребовать оптимизации концентраций и времени воздействия тимидина, реверсина и нокодазола.
- Метод ограничен моделями in vitro; применимость к первичным тканям или моделям in vivo в исходных материалах не рассматривалась.
Часто задаваемые вопросы по биофармацевтике
Chapters in this video
0:04
Title
0:32
Synchronization of RPE-1 hTERT Cells
1:34
Generation of Aneuploid Cells by Interference with the Activity of the Mitotic Kinase Mps1 and Removal of Aneuploid Cycling Cells to Enrich the ArCK Population
3:36
Results: In Vitro Isolation and Characterization of Aneuploid Cells with Complex Karyotypes (ArCK)
4:35
Conclusion
