Поколение и изоляции арестован клеточного цикла клетки с сложных получен

Общая цель этого протокола состоит в том, чтобы предоставить простой метод генерации и изоляции клеток, остановленных клеточным циклом, со сложными кариотипами. Этот метод может дать ответы на ключевые вопросы в области исследования анеуплоидии, такие как взаимодействие иммунной системы с анеуплоидными клетками. Основное преимущество этого метода заключается в том, что он генерирует популяцию клеток, которая содержит только сложные кариотипы.

Чтобы начать синхронизацию клеток RPE-1 hTERT, используйте только что размороженные клетки и распределите их в 10-сантиметровую чашку для культуры тканей, используя восемь миллилитров стандартной питательной среды. Далее с помощью гемоцитометра определяют номер клетки. Затем инкубируйте клетки на ночь.

На следующий день замените стандартную питательную среду на среду, содержащую пять миллимоляров тимидина. Инкубируйте в течение 24 часов при температуре 37 градусов Цельсия для синхронизации клеток на границе G1S. Через 24 часа трижды промыть клетки PBS.

Затем добавьте стандартную питательную среду в промытые клетки и инкубируйте в течение шести часов при температуре 37 градусов Цельсия. Для начала промойте клетки 10 миллилитрами PBS. Затем добавьте среду, содержащую 500 наномолярных ингибиторов Mps1 реверсина.

Выдерживать в течение 12 часов при температуре 37 градусов Цельсия. На следующий день трижды промыть клетки с помощью PBS. Затем добавьте стандартную питательную среду и верните пластины в инкубатор.

Примерно через 72 часа после первого аберрантного митоза промойте клетки 10 миллилитрами PBS. Затем добавьте среду, содержащую 330 наномолярного нокодазола. Выдерживать в течение 12 часов при температуре 37 градусов Цельсия.

На следующий день аспирируйте нокодазол медиумом. Затем добавьте в блюдо три миллилитра PBS и постучите по краю тарелки, чтобы стряхнуть митотические клетки. Поворачивайте пластину между каждым нажатием, чтобы обеспечить равномерное удаление митотических клеток.

После первоначального оттряхивания аспирируйте любую жидкость, прилипшую к крышке и краю пластины. Затем проверьте пластину под микроскопом при 10-кратном увеличении. Затем промойте клетки пятью миллилитрами PBS.

Далее добавьте среду, содержащую 330 наномолярный нокодазол. Выдерживать в течение 12 часов при температуре 37 градусов Цельсия. После окончательного оттряхивания добавьте 10 миллилитров стандартной питательной среды.

Инкубируйте клетки в течение 12-24 часов при температуре 37 градусов Цельсия перед проведением анализов. Оставшиеся на пластине клетки называются арестованными со сложным кариотипом или клетками ArCK. Этот протокол описывает простой метод выделения клеток ArCK, и для подтверждения их выделения анализируются некоторые особенности, специфичные для клеток ArCK.

Клетки ArCK демонстрируют повышенный уровень ингибиторов клеточного цикла p53, p21 и p16 в иммуноблоттинге, в то время как эуплоидные и анеуплоидные циклические клетки этого не делают. Кроме того, клетки ArCK позитивны на бета-галактозидазу, связанную со старением, которая окрашивает в сине-зеленый цвет, в то время как эуплоидные контрольные клетки - нет. Графики сегментации показывают, что клетки ArCK являются анеуплоидными, характеризующимися множественными, случайными приростами хромосом и потерями хромосом.

Сегментационные графики показывают количество копий одиночных клеток от хромосомы 1 до X, относительно эуплоидной шкалы референса log two. Пытаясь выполнить эту процедуру, важно убедиться, что вы удаляете все митотические клетки во время каждого встряхивания. После выполнения этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как анализ на цитокины.

Эти анализы помогут ответить на дополнительные вопросы, такие как способность клеток ArCK взаимодействовать с клетками иммунной системы. Не забывайте, что нокодазол опасен. Во время использования данного реагента следует надевать соответствующие средства индивидуальной защиты.

После освоения эта техника может быть использована для эффективной изоляции клеток ArCK in vitro. Эту процедуру можно провести за семь дней при правильном выполнении.