Изоляция Брюшина производные тучных клеток и их функциональные характеристики с Ca^{2 +}-изображений и дегрануляции анализов

Эти методы могут помочь ответить на ключевые вопросы в области внутриклеточной передачи сигналов на возбудимых клетках, например, какие ионные каналы имеют решающее значение для активации иммунных клеток и высвобождения медиаторов. Основными преимуществами этих методик являются их относительная простота и возможность одновременного анализа большого количества клеток. Визуализацию кальция Fura-2 в тучных клетках будет демонстрировать Катрин Оленшлагер, аспирант моей лаборатории.

Чтобы начать эту процедуру, распылите на усыпленную мышь 70% этанола и закрепите его на поролоновом блоке тыльной стороной вниз с помощью булавок. С помощью ножниц с тупым краем снимите кожу над брюшной полостью мыши и не повредите брюшную полость. Затем введите семь миллилитров ледяной среды RPMI в брюшную полость, осторожно вставив иглу 27 калибра в брюшину.

Не перфорируйте никакие органы, а используйте пятно в области жировой ткани придатка яичка, чтобы снизить риск перфорации органа. После инъекции встряхните мышь в течение одной минуты, чтобы отсоединить клетки брюшины от среды RMPI. Не встряхивайте мышь слишком сильно, чтобы не повредить внутренние органы и не загрязнить кровью брюшную полость.

Затем повторно используйте шприц, оснастив его новой канюлей 20 калибра. Сдвиньте внутренние органы в одну сторону, наклонив поролоновый блок и осторожно постучав им по скамье, чтобы облегчить аспирацию среды с другой стороны. Затем вставьте иглу 20 калибра со скосом, чтобы осторожно и медленно отсасывать жидкость из брюшной полости, чтобы избежать закупорки внутренними органами.

Соберите как можно больше жидкости. Затем извлеките иглу из шприца и перенесите собранную клеточную суспензию в сборную пробирку на лед. Выбросьте пробирку с образцом, если есть видимое загрязнение крови.

Центрифугируйте пробирку с чистой клеточной суспензией при 300 г в течение пяти минут. Под стерильный капюшон сделайте аспирацию надосадочной жидкости. Повторно суспендируйте гранулы образца в холодной среде PMC и перенесите клеточную суспензию в колбу для клеточных культур площадью 25 квадратных сантиметров.

Затем добавляют факторы роста IL-3 и SCF до конечных концентраций 10 нГ на миллилитр и 30 нГ на миллилитр соответственно. Инкубируйте клетки в течение примерно 48 часов при температуре 37 градусов Цельсия до следующей процедуры. На 12-15 день, если планируются эксперименты со стимуляцией плазмалеммальных рецепторов IgE, предварительно обработайте клетки на ночь 300 нанограммами на миллилитр анти-ДНФ IgE в стандартной питательной среде.

Для приготовления Фура-2 для визуализации необходимо развести стоковый раствор Фура-2, АМ в кальциевом HBSS до конечной концентрации пяти микромоляров с целью приготовления загрузочного буфера. Затем смешайте 500 микролитров загрузочного буфера с 500 микролитрами суспензии клеток PMC. Нанесите смесь пипеткой в камеру визуализации и инкубируйте клетки в течение 20–30 минут при комнатной температуре в темноте.

Настройте систему подачи под действием силы тяжести с различными растворами в соответствии с протоколом стимуляции. Далее монтируем систему нанесения на предметный столик инвертированного микроскопа. Подготовьте 40-кратный светосильный масляный иммерсионный объектив, нанеся на него небольшую каплю иммерсионного масла.

Поместите камеру визуализации с загруженными элементами в систему нанесения и закрепите ее, чтобы предотвратить движение во время записи. Затем включите проходящий свет и сосредоточьтесь на клетках. Затем запустите программу получения изображений в режиме физиологического сбора данных.

Откройте окно настройки и отрегулируйте фокус и оптимальное время захвата. Представьте себе эталонное изображение и отметьте ячейки как ROI. Отметьте последний ROI в области, где нет ячеек, и определите ее в качестве фона.

Затем завершите настройку и начните измерение с пятисекундной скоростью захвата. Затем добавьте решения с правильным номером цикла в соответствии с планом эксперимента. Чтобы измерить антиген-индуцированное повышение внутриклеточной концентрации кальция, применяйте раствор шприца-два после цикла 20 и прекращайте запись после цикла 150.

Чтобы измерить индуцированное соединением 48/80 повышение внутриклеточной концентрации кальция, применяйте раствор шприца-три после цикла 20 и прекращайте запись после цикла 150. Чтобы измерить повышение внутриклеточной концентрации кальция, вызванное SOCE, применяют раствор шприца-4 после цикла 10, применяют раствор шприца-5 после цикла 70, применяют раствор шприца-4 после цикла 120, применяют раствор шприца-один после цикла 150 и прекращают запись после цикла 220. В программе сбора данных последовательно нажимайте кнопки «Начать резать», «Отметить все», «Преобразовать все», «Измерения физиологии», «ОК», а затем снова нажать «ОК».

Сохраните файлы в виде таблиц и стеков изображений для анализа в автономном режиме. Чтобы измерить высвобождение бета-гексозаминидазы, перенесите 100 микролитров клеточной суспензии на лунку с V-образным дном на 96 лунок. Добавьте в каждую лунку по 25 микролитров раствора для стимуляции или контроля.

Затем инкубируйте клетки в течение 45 минут при температуре 37 градусов по Цельсию. После этого остановите реакцию, поместив 96-луночный планшет на лед на пять минут. Затем центрифугируйте планшет при температуре четыре градуса Цельсия в течение четырех минут при 120 г.

Перелейте 120 микролитров надосадочной жидкости в 96-луночный планшет с плоским дном и положите его на лед. Тщательно избегайте прикосновения к клеточным гранулам, но полностью отсасывайте надосадочную жидкость. Далее добавьте в клеточные гранулы 125 микролитров буфера для лизиса.

Инкубируйте клеточные гранулы в течение пяти минут при комнатной температуре и повторно суспендируйте их после инкубации путем повторного пипетирования. Пипеткой 25 мкл четырехмиллимолярного раствора pNAG в необходимые лунки нового плоскодонного 96-луночного планшета. В приготовленный раствор пНАГ добавить по 25 микролитров каждой надосадочной жидкости и по 25 микролитров каждого клеточного лизата отдельно.

Инкубируйте реакционные партии в течение одного часа при температуре 37 градусов Цельсия. После инкубации пипеткой в каждую лунку впрыскивают по 150 микролитров стоп-раствора, чтобы остановить реакцию. Затем проанализируйте поглощение света образца пластины с помощью микропланшетного ридера на 405 нанометрах с опорными 630 нанометрами для автоматического вычитания фона.

В программе сбора данных поставьте галочку в поле «Справочник», а в меню элемента программы поглощения выберите 630 нанометров для автоматического вычитания фона. Анализ высвобождения бета-гексозаминидазы был проведен для проверки способности выделенных ПВК, которые подвергаются дегрануляции при сшивании высокоаффинных рецепторов плазмалеммального IgE или стимуляции рецепторов Mrg PRB2. Ячейки добавляли к 96-луночному планшету с V-образным дном и стимулировали по этой схеме в течение 45 минут при температуре 37 градусов Цельсия.

После центрифугирования и удаления надосадочной жидкости гранулы лизировали. Затем содержание бета-гексозаминидазы в отдельных надосадочных зонтантах и лизатах гранул было проанализировано по их реакциям с pNAG во время часовой инкубации при 37 градусах Цельсия. Количество продуктов реакции определяли колориметрически и рассчитывали процент высвобожденной бета-гексозаминидазы.

Спонтанное высвобождение было очень низким, в то время как реакция на сильные раздражители дегрануляции, такие как 10 микромольный иономицин и соединение 48/80 в концентрации 50 микрограммов на миллилитр, составила более 40% и 60% соответственно. Реакция дегрануляции на стимуляцию ДНФ зависела от дозы в диапазоне концентраций от 10 до 300 мг на миллилитр. В совокупности эти данные однозначно указывают на хорошее функциональное состояние изолированных ЧВК.

Используя эту методику, вы получите высокочистую популяцию зрелых тучных клеток соединительной ткани мышей, полученных из брюшины, в течение двух недель. Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить о поддержании стерильных условий во время изоляции и культивирования клеток, чтобы избежать бактериального загрязнения. После этой процедуры можно использовать другие методы, такие как электрофизиологические измерения ионного тока с помощью патч-клэмпа, чтобы ответить на дополнительные вопросы, касающиеся путей проникновения кальция в тучные клетки.

После своего развития метод внутриклеточной визуализации кальция Fura-2 проложил путь исследователям в области физиологии массовых клеток к изучению кальциевой зависимости дегрануляции тучных клеток. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как проводить эксперименты по визуализации кальция Fura-2 и анализ дегрануляции бета-гексозаминидазы с тучными клетками. Не забывайте, что работа с ультрафиолетовым излучением может быть опасной для глаз и кожи, поэтому при выполнении этой процедуры следует избегать ненужного воздействия.