Сочетание Оптогенетика с искусственных микроРНК охарактеризовать последствия нокдаун гена на пресинаптическом функции внутри нетронутыми нейронных цепей

Общая цель объединения искусственной микроРНК-опосредованной РНК-интерференции с оптогенетикой состоит в том, чтобы охарактеризовать влияние нокдауна гена на пресинаптическую функцию в интактных нейронных цепях. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области синаптической физиологии, такие как рассмотрение физиологической роли пресинаптических белков в интактных цепях мозга. Основное преимущество этой методики заключается в том, что она позволяет избирательно контролировать синаптическую передачу на нейронах со сниженной экспрессией исследуемого пресинаптического белка.

Кроме того, мы использовали этот метод для исследования пресинаптической функции в острых срезах мозга. Его также можно применять для манипулирования и зондирования нейронной безопасности in vivo. Демонстрировать процедуру будет Кармела Витале, аспирантка нашей лаборатории.

После проектирования микроРНК и конструирования рекомбинантного вектора для экспрессии микроРНК и оптогенетического зонда подготовьте первичные нейрональные культуры из интересующей области мозга. Для этого необходимо следовать установленному протоколу кортикокультивирования от L.A.Cingolani and Company со следующими изменениями. Во-первых, используйте шестилуночные планшеты, полмиллиона нейронов на лунку и 2,5 миллилитра среды для прикрепления на лунку.

После инкубации планшета в течение четырех часов переключитесь на 3,3 миллилитра поддерживающей среды на лунку, а если наблюдается чрезмерный рост астроцитов, добавьте 0,5 мл поддерживающей среды с добавлением 7,5 микромоляров AraC при трех-четырех ДЕЛ. При пяти-шести DIV заинфицируйте три лунки для каждой микроРНК для тестирования. Используйте самую низкую инфекционную дозу, которая заразит не менее 99% нейронов.

Добавьте вирус непосредственно в нейроны, аккуратно перемешайте и поместите пластины обратно в инкубатор при температуре 37 градусов Цельсия. При 17-18 DIVs лизируйте нейроны для экстракции РНК. Наклоните пластины и с помощью стеклянных пипеток удалите всю среду из каждой лунки.

Затем сразу же добавьте в каждую лунку по 700 микролитров реагента для лизиса. После непродолжительного перемешивания переложите лизат клеток из каждой лунки в отдельные пробирки объемом 1,5 миллилитра. Затем добавьте 140 микролитров хлороформа в каждый лизат.

Быстро закройте пробирки и энергично встряхните их в течение 15 секунд, чтобы эмульгировать содержимое. Затем центрифугируйте пробирки при 12 000 умноженных на G в течение 15 минут при четырех градусах Цельсия. Затем осторожно перенесите верхнюю водную фазу, содержащую РНК, в новую пробирку.

Не допускайте соприкосновения наконечника пипетки с органической фазой. В водную фазу добавляют 1,5 объема 100% этанола и пипеткой медленно трижды перемешивают. Затем очистите РНК с помощью коммерчески доступного набора и количественно оцените выход.

Ожидайте не менее 3,5 микрограммов на образец. Соотношение чистоты по белкам и органическим соединениям должно быть не менее 1,9. Затем используйте набор для ретротранскрибации 250, 500 или 1000 нанограммов РНК.

Затем количественно оцените эффективность нокдауна для эндогенного гена, представляющего интерес, с помощью количественного RTPCR. Стремитесь к эффективности нокдауна не менее 60%Для этого протокола используйте животное, которому за 15 дней до этого или дольше вводили RAAV12 в мозг в соответствии с ранее опубликованным протоколом A.Cetin and Company. Изолируйте мозг и сделайте острые срезы мозга с помощью вибратома и газированного ледяного ACFF.

Соберите срезы интересующей области и сведите к минимуму их воздействие света, чтобы избежать активации оптогенетического зонда. Дайте ломтикам восстановиться в течение 30 минут при 37 градусах Цельсия в том же ACFF. Используйте камеру, специально предназначенную для удержания срезов мозга.

Затем верните ломтики до комнатной температуры, где они останутся здоровыми в течение шести-восьми часов. Чтобы продолжить, перенесите срез в записывающую камеру и переплавьте его с точностью два миллилитра в минуту ACFF. Далее кратко проверьте сигнал выраженного флуоресцентного репортера, чтобы выяснить локализацию и интенсивность инфекции.

Затем заполните патч-электрод внутриклеточным раствором. Теперь, под инфракрасным излучением, получите плотно закрытую конфигурацию на нейроне, который получает синаптические входы от инфицированных нейронов. Сопротивление серии можно оставить некомпенсированным, но оно должно быть постоянным и низким.

Например, если пирамидальные нейроны CA3 были инфицированы, патч на пирамидальных нейронах находится в проксимальном и медиальном тракте области CA1. Когда клетки начинают выглядеть сморщенными или опухшими, когда исправление становится затруднительным или партии становятся нестабильными, то выбранные срезы уже недостаточно здоровы для записи. Затем используйте фармакологию для выделения исследуемых синаптических токов.

Например, если целью является исследование возбуждающей синаптической передачи, заблокируйте тормозящую синаптическую передачу, добавив бикукулин в ванну. Затем вызовите синаптические токи, такие как возбуждающие постсинаптические токи, с помощью синего лазера с яркостью 473 нанометра, соединенного с оптическим волокном, расположенным на соматах инфицированных нейронов. Не направляйте лазер на аксоны нейронов.

Например, избегайте попадания света на коллатерали Шаффера. Прямая деполяризация аксонов нежелательна. Затем отрегулируйте длину стимуляции до минимума, чтобы снизить вероятность вызова более одного потенциала действия за один световой импульс.

Затем уточните интенсивность лазера, чтобы вызвать небольшой, но четко обнаруживаемый синаптический ток. Например, для возбуждающей синаптической передачи между пирамидальными нейронами CA3 и CA1 отрегулируйте интенсивность лазера так, чтобы она вызывала синаптические токи со скоростью от 20 до 50 пикоампер. В конце эксперимента нанесите тетродотоксин на 0,5 микромоляра для блокировки натриевых каналов.

Чувствительность оптически вызванных токов к тетродотоксину указывает на то, что они обусловлены потенциалом действия. Продолжайте собирать данные до тех пор, пока не будет выделено по крайней мере восемь нейронов для данного состояния по крайней мере от трех разных животных. Это минимальный объем данных, необходимый для анализа результатов.

С помощью описанного метода были сбиты альтернативные сплайс-изоформы пресинаптических потенциал-зависимых кальциевых каналов P/Q-типа. Считается, что эти каналы регулируют кратковременную синаптическую пластичность в возбуждающих синапсах от CA3 до CA1. Были созданы четыре различные конструкции, экспрессирующие изоформ-специфичные микроРНК; каждый из них экспрессировался вместе со сверхбыстрым каналом родопсина вместе с флуоресцентным белком Td-Tomato.

Во-первых, было подтверждено, что каждый конструкт обладает достаточной эффективностью нокдауна и селективностью в первичных культурах нейронов крыс с использованием изоформ-специфичного количественного RTPCR. Затем каждый конструкт был введен в гиппокамп крыс P18. В конечном счете, влияние этих конструкций на кратковременную синаптическую пластичность в синапсах СА3-СА1 было исследовано путем стимуляции инфицированных пирамидальных нейронов СА3 короткими импульсами света с яркостью 473 нм и регистрации полученных ЭПСК в оптовой конфигурации из пирамидных нейронов области СА1.

Нокдаун различных изоформ сплайсинга влиял на реакцию на парную импульсную стимуляцию в противоположных направлениях. Нокдаун изоформы А, усиленный фасилитацией парного импульса; в то время как нокдаун изоформы B упразднил его. Сочетание оптогенетики РНК-интерференции позволяет проводить исследования в области синаптической физиологии для изучения того, как пресинаптические белки регулируют краткосрочную синаптическую пластичность в интактных цепях.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как проверить микроРНК на РНК-интерференцию и как объединить их с оптогенетикой для исследования синаптической передачи в острых срезах мозга.