Electrochemiluminescence анализов для человека островок аутоантител

Общей целью этого электрохемилюминесцентного анализа является обнаружение островковых атутоантител при аутоиммунном диабете первого типа, обладающих высокой чувствительностью и высокой специфичностью. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области диабета первого типа, такие как время зарождения аутоиммунитета островковых клеток и прогнозирование высокого риска диабета первого типа. Основным преимуществом этого метода является более чувствительный, более специфичный к заболеванию и нерадиоактивный по сравнению с текущими стандартными радиоанализами.

Применение этого метода распространяется на прогнозирование и диагностику диабета первого типа, потому что эти островковые аутоантитела появляются за месяцы или годы до симптоматического клинического заболевания. Хотя этот метод может дать представление о предикации диабета первого типа, он также может быть применен для изучения других аутоиммунных заболеваний, таких как аутоантитела к трансглютаминазе при целиакии, ТПО и тиреоглобулин при аутоиммунном заболевании щитовидной железы и некоторых других. Впервые идея этого метода пришла нам в голову, когда мы обнаружили, что этот метод основан на высокой чувствительности и отсутствии радиоактивности.

В отличие от обычного метода ИФА, который не очень хорошо работает для обнаружения аутоантител к островкам. Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, так как анализ на аутоантитела к инсулину с лечением сывороточной кислотой трудно описать в тексте. Демонстрировать процедуру будет Йонг Гу, постдок из моей лаборатории.

Сначала смешайте островковый аутоантиген человека с биотином или SULFO-TAG в соотношении один к пяти молярам в пробирке. И накройте трубку алюминиевой фольгой, так как обе метки светочувствительны. Затем выдержите трубку в течение часа при комнатной температуре.

Тем временем, когда инкубация идет полным ходом, заполните спин-колонну двухкратным фосфатным буферным раствором. Затем центрифугируйте колонку при давлении в 1000 раз в течение двух минут каждый раз. Затем центрифугируйте смесь аутоантигенных меток в спиновой колонке при 1000-кратном течении силы тяжести в течение двух минут.

Затем аликвотируйте и храните меченый антиген при температуре минус 80 градусов Цельсия. Далее с помощью рациональной концентрации меченого антигена биотина SULFO-TAG на основе шахматного анализа для антигенного буфера готовят три миллилитра раствора антигена на 96-луночный планшет. Затем в каждую лунку добавьте по четыре микролитра сыворотки и доведите итоговый объем до 20 микролитров с одним кратным фосфатным буферным раствором.

Затем добавьте по 20 микролитров меченого раствора антигена в каждую лунку. И накройте пластину герметизирующей фольгой, предотвратите попадание света. Затем переложите тарелку на шейкер при комнатной температуре на два часа.

Как только шейкер остановится, оставьте тарелку при температуре четыре градуса Цельсия в холодильнике на 18-24 часа. Теперь смешайте 15 микролитров сыворотки с 18 микролитрами 0,5 молярной уксусной кислоты для каждого образца и инкубируйте то же самое при комнатной температуре в течение 45 минут. На основании шахматного анализа для приготовления раствора антигена используют рациональную концентрацию меченого антигена биотина SULFO-TAG.

Затем внесите 35 микролитров антигенного буфера в каждую лунку нового ПЦР-планшета. Непосредственно перед окончанием курса инкубации сывороточной смеси добавьте 3,8 микролитра одного молярного трис-буфера при PH 9, рядом с каждой лункой на антигенной пластине. Как только инкубация закончится, быстро перелейте 25 микролитров сыворотки, обработанной уксусной кислотой, в каждую лунку антигенной пластины и перемешайте раствор.

Затем накройте ПЦР-планшет герметизирующей фольгой, чтобы избежать попадания света, и поместите на шейкер при комнатной температуре на два часа. Как только это будет сделано, перенесите тарелку при температуре четыре градуса Цельсия в холодильник и выдерживайте от 18 до 24 часов. Достаньте пластину со стрептавидином из холодильника при температуре четыре градуса Цельсия и дайте пластине нагреться до комнатной температуры.

После того, как стрептавидиновая пластина достигнет комнатной температуры, добавьте в каждую лунку по 150 микролитров 3%-ного блокатора А, накройте ПЦР-планшет герметизирующей пленкой и выдерживайте в холодильнике в течение ночи. На следующий день достаньте пластину со стрептавидином из холодильника и изгоните буфер из лунок. Затем высушите тарелку, поставив ее вверх дном на бумажные полотенца, чтобы оставшийся буфер пропитался.

Затем добавьте 150 микролитров одного буфера PBST, чтобы промыть колодец в течение трех последовательных стирок. Далее перелейте по 30 микролитров сывороточного антигена, инкубируйте в каждую лунку стрептавидиновую пластину и накройте пластину фольгой, чтобы избежать попадания света. Затем переложите тарелку на шейкер при комнатной температуре на час.

Через час выбросьте антиген сыворотки, инкубируйте с тарелки и добавьте 150 микролитров одного кратного PBST буфера, чтобы промыть лунку в течение трех раз. Как только промывка закончится, добавьте 150 микролитров буфера для чтения в каждую лунку для чтения на планшетном ридтере. Перед анализом любых неизвестных образцов был установлен порог для каждого анализа на аутоантитела путем тестирования около 100 пациентов с диабетом первого типа и около 100 здоровых контрольных групп.

Затем была построена ROC-кривая для определения оптимального индекса верхней границы нормы для анализа GADA, который составлял 0,023, чтобы получить наилучшую чувствительность и специфичность. Затем был рассчитан результат неизвестной выборки с использованием уравнения, полученного из высоких положительных, низких положительных и отрицательных контрольных стандартов. Далее был построен график для определения сигналов, полученных в анализе островковых аутоатиbody на инкубацию моноклонального антитела инсулина с нормальной сывороткой крови человека в присутствии и отсутствии кислотной обработки.

На графике видно, что сигнал заметно блокируется при добавлении нормальной сыворотки при отсутствии кислотной обработки. Напротив, получаемый сигнал сравнительно выше, когда сыворотку подвергают кислотной обработке перед инкубацией с моноклональным антителом инсулина. Аналогичный график был также построен для определения сигналов, полученных с использованием сыворотки крови чужеродных пациентов в присутствии и отсутствии кислотной терапии.

Обработка сыворотки крови пациента кислотой перед инкубацией с антителом значительно увеличивает сигналы в анализе на островковые аутоантитела по сравнению с отсутствием лечения. После освоения этой техники можно легко проделать несколько сотен образцов за один день, если она правильно отформована. Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить о выполнении шахматного анализа для каждого анализа на аутоантитела, чтобы оптимизировать условия анализа.

После своего развития этот метод проложил путь исследователям в области аутоиммунного диабета первого типа для прогнозирования и профилактики. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, насколько легко выполнить этот анализ. Не забывайте, что работа с образцами сыворотки может быть опасной и заразной.

Во время выполнения этой процедуры всегда следует соблюдать меры предосторожности, чтобы избежать прямого контакта с кожей.