Кролик модель прочного трансген выражения в яремной для общей сонной артерии взаиморасположение графтов

Этот метод может ответить на ключевые вопросы о патогенезе отторжения венозного трансплантата. Например, он может идентифицировать медиаторы отторжения трансплантата и стратегии тестирования, направленные на предотвращение отторжения трансплантата. Основным преимуществом данной методики является ее способность достигать длительной, стабильной экспрессии трансгена в эндотелии венозного трансплантата.

После обезболивания кролика согласно текстовому протоколу оббрейте животное от грудинной выемки до края нижней челюсти. По завершении хирургической установки с помощью электрокаутеризации разрежьте кожу по средней линии между грудинной выемкой и нижней челюстью, примерно от семи до девяти сантиметров в длину. Затем прикрепите зажимы для полотенец, чтобы держать разрез открытым.

Тупо рассекаем под фасцией по всей средней линии. Затем с помощью электрокоагуляции разрезать рассеченный фасциальный слой по средней линии. Затем, начиная с правой стороны, рассеките между грудинной подъязычной мышцей, расположенной над трахеей, и грудинной мышцей, чтобы обнажить общую сонную артерию.

Затем тщательно рассекают четырех-пятисантиметровый сегмент общей сонной артерии и ее более крупные ветви, свободные от окружающих тканей. Используйте шелковые швы 5-0 для перевязки больших ветвей общей сонной артерии, прежде чем разрезать каждую ветвь дистальнее шва. После повторения рассечения на левой общей сонной артерии, с помощью тканевых удерживающих щипцов временно закрыть слой подкожной клетчатки.

Затем рассекайте поверхностную фасцию от кожи с правой стороны до тех пор, пока не обнажится наружная яремная вена. Рассеките четырех-пятисантиметровый сегмент наружной яремной вены и освободите его ветви от окружающих тканей. Используйте шелковые швы 5-0, чтобы перевязать ветви, затем обрежьте ветки.

Затем перевяжите изолированную вену с обоих концов, перережьте краниальный конец и промойте просвет гепаринизированным физиологическим раствором. Чтобы провести пересадку вены, используйте сосудистый зажим, чтобы пережать правую общую сонную артерию на краниальном конце изолированного сегмента. Затем поместите сосудистый зажим на каудальный конец.

Теперь проведите каудальную артериотомию точно краниально к каудальному зажиму, равному по длине диаметру краниального конца венозного сегмента. Затем введите внутривенный катетер, соединенный со шприцем гепаринизированного нормального физиологического раствора, через каудальную артериотомию и промойте просвет сонной артерии. Жидкость будет выводиться через артериотомию.

Вернувшись к яремной вене, иссекают вену и закладывают ее рядом с сонной артерией. С помощью одиночных швов полипропиленового шва 7-0 каудальный конец каудальной артериотомии прижимается к краниальному концу сегмента вены. Затем наложите второй стежок под углом 180 градусов от первого стежка, чтобы сшить краниальный край каудальной артериотомии с краниальным концом сегмента вены.

Наложите третий стежок в точке, равноудаленной от первых двух стежков на боковой стороне анастомоза. Затем нанесите четвертый стежок на медиальную сторону анастомоза, равноудаленную от первых двух стежков и поперек третьего стежка. Поставьте четыре дополнительные петли между каждым стежком с первого по четвертый.

Выполните краниальную артериотомию на каудальной стороне дистального отдела. Расстояние между краниальным концом краниальной артериотомии и каудальным концом каудальной артериотомии должно быть таким же, как длина сегмента вены. Длина краниальной артериотомии равна диаметру каудального конца сегмента вены.

Если вена вытянута краниально от анастомоза вдоль сонной артерии, убедитесь, что вена не перекручена. Затем используйте гепаринизированный нормальный физиологический раствор для промывания сонной артерии и вены с помощью краниальной артериотомии. Затем наложите первый шов, чтобы сшить каудальный конец краниальной артериотомии с каудальным концом сегмента вены.

Затем наложите второй стежок под углом 180 градусов от первого стежка, чтобы сшить краниальный край краниальной артериотомии до каудального конца сегмента вены. Завершите анастомоз, как показано ранее в видео. Временно освободите черепной зажим, чтобы венозный трансплантат заполнился кровью, и слегка надавите сухой марлей, чтобы остановить кровотечение.

Повторяйте этот шаг до тех пор, пока анастомоз не перестанет кровоточить. Затем снимите черепные и каудальные зажимы. Используйте марлю, чтобы остановить любое дополнительное кровотечение в области анастомозов.

Используйте шелковый шов 3-0, чтобы перевязать оба конца общего сегмента сонной артерии между анастомозами. Затем разделите сонную артерию посередине между лигатурами. В венозном трансплантате должны быть видны энергичные пульсации.

Повторите установку венозного трансплантата с левой стороны. С помощью шва 5-0 PGA закройте подкожную клетчатку непрерывным рисунком. Затем с помощью шва 3-0 PGA закройте кожу внутрикожным рисунком и закопайте узлы с обоих концов.

Проводить послеоперационный уход и чрескожное УЗИ согласно текстовому протоколу. Чтобы провести операцию по переносу генов, осторожно изолируйте правый венозный трансплантат, включающий от 1,5 до двух сантиметров сонной артерии, прилегающей к трансплантату, как с краниальной, так и с каудальной стороны. Повторите рассечение с левой стороны таким же образом.

Используйте обычный физиологический раствор для заполнения полости хирургической раны с правой стороны, чтобы обеспечить передачу звуковых волн. Подсоедините двухмиллиметровый периваскулярный датчик потока к объемному расходомеру и погрузите зонд в физиологический раствор в полости раны. Установите расход на ноль.

Поместите проточный зонд вокруг сонной артерии, каудальной или краниальной, к венозному трансплантату. Затем используйте электронную систему сбора данных для записи данных с датчика потока. После введения гепарина кролику через внутривенный катетер и промывания его физиологическим раствором используйте сосудистый зажим, чтобы пережать общую сонную артерию на краниальном конце венозного трансплантата.

А затем наложите второй зажим на сонную артерию примерно на 10 миллиметров каудально к каудальному анастомозу, чтобы освободить место для артериотомии. Затем свободно наложите две шелковые завязки вокруг сонной артерии чуть ближе к венозному трансплантату. Далее с помощью заранее подготовленной изогнутой иглы 21 калибра проколите каудальную сонную артерию к трансплантату и просто краниально к каудальной сосудистой клипсе.

Дважды проведите иглу в просвет вперед и назад, чтобы убедиться, что просвет чистый. Затем осторожно извлеките иглу. После подготовки шприца и внутривенного катетера с DMEM согласно текстовому протоколу введите его в общую артериотомику сонной артериомии до точки изгиба и промойте просвет венозного трансплантата, заполнив его 0,5 миллилитрами DMEM два раза.

Извлеките DMEM из трансплантата, слегка надавливая пальцем в перчатке на краниальный конец трансплантата. Затем осторожно проведите пальцем вдоль трансплантата по направлению к каудальному концу трансплантата, чтобы вымыть содержимое просвета через артериотомию. Извлеките шприц DMEM из катетера, оставив катетер в сосуде.

Подсоедините шприц с раствором вируса, следя за тем, чтобы воздух не попал в катетер. Сдвиньте слабо завязанные шелковые галстуки вниз по артерии до тех пор, пока они не окажутся вокруг кончика катетера, но не затягивайте их. Влейте 0,03 миллилитра вирусного раствора, чтобы вытолкнуть оставшийся DMEM из катетера.

Затем с помощью пальца удалите всю жидкость из просвета венозного трансплантата, мягко надавливая от краниального к каудальному. Затяните две завязки вокруг артерии и кончика катетера, чтобы закрыть просвет. Затем вводите раствор вируса до тех пор, пока вена не будет расширена.

Аккуратно положите шприц вниз на гнездо из марли. Через 20 минут с помощью пустого шприца аккуратно отсасывайте вируссодержащий раствор из трансплантата до тех пор, пока сосуд не разрушится. Извлеките шприц, оставив катетер на месте.

Затем разрежьте и развяжите шелковые швы и извлеките катетер из сосуда. Теперь используйте полипропиленовый шов 7-0 по X-образной схеме, чтобы закрыть артериотомию. Затем аккуратно потяните за концы швов и завяжите их между собой двумя квадратными узлами.

После восстановления кровотока в трансплантате правой вены, как описано в текстовом протоколе, повторите инфузию вируса с левой стороны. Чтобы собрать трансдуцированные трансплантаты, рассеките свободные венозные трансплантаты и общие сонные артерии и выполните измерения кровотока как с левой, так и с правой стороны, как было показано ранее. С помощью шелкового шва 3-0 перевязать правую общую сонную артерию краниально к трансплантату.

Затем с помощью шелкового шва 3-0 перевязать каудальную сонную артерию к трансплантату. Иссекайте трансплантат правой вены, разделив прилегающую сонную артерию между каждой из перевязок и прилегающим анастомозом. Затем удалите венозный трансплантат у кролика и используйте физиологический раствор для промывания просвета.

Первым этапом, которого должен достичь новый оператор, является стабильная проходимость венозного трансплантата как после первоначальной операции по пересадке вены, так и после последующей операции по отсроченной трансдукции. Когда венозный трансплантат является патентованным, ультразвуковое исследование выявит крупный кровеносный сосуд с быстрым каудальным и черепным кровотоком. Графты были собраны через три дня после трансдукции, разрезаны на срезы и окрашены X-gal.

Визуализация просветных поверхностей на лице показала венозные трансплантаты с эффективной трансдукцией и плохой трансдукцией. Как показано на этом графике, уровни мРНК бета-галактозидазы в трансплантатах вен, трансдуцированных новым оператором, существенно не отличались от уровней мРНК бета-галактозидазы в трансплантатах вен, трансдуцированных опытным оператором. При выполнении этого протокола важно помнить о реверсивном трансплантате вены краниально в каудальную до сокращения анастомоза.

Это необходимо для того, чтобы избежать обструкции кровотока венозным болюсом. После освоения эти операции могут быть завершены примерно за три часа для процедуры пересадки вены, два часа для процедуры переноса гена венозного трансплантата и 45 минут для процедуры забора. Не забывайте, что поскольку этот протокол требует работы с вирусными векторами и острыми предметами, необходимо соблюдать надлежащие процедуры биобезопасности и острых предметов.