Изготовление язык внеклеточного матрикса и воссоздание язык плоскоклеточный рак в пробирке

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области исследований рака полости рта, например, как построить подходящую Т-ассист-модель in vitro. Основное преимущество этой методики заключается в том, что реконструированный ТСКК выражает характеристики опухоли, которые имеют сильное сходство с клинической гистопатологией ТСКЦ. Когда впервые появилась идея этого метода, мы поняли, что двумерные культивируемые клетки TSCC не проявляют должным образом нативный фенотип TSCC.

Кроме того, мы осознали важность внеклеточного матрикса для выживания и дифференцировки рака. Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, так как получение внеклеточного матрикса языка и 3D-культуры с использованием мини-биореактора трудно освоить только с помощью слов, и лучше всего рассматривать их для уточнения. После выделения языков у усыпленных мышей согласно текстовому протоколу погрузите ткань в 75% этанол на три минуты.

Затем переложите каждый язычок в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитра, с одним миллилитром 10 миллиМоляр стерильного PBS. Чтобы провести лизис клеток, заморозьте языки при температуре минус 80 градусов Цельсия на один час. Затем разморозьте ткань при комнатной температуре в течение 45 минут.

Повторите замораживание/размораживание еще два раза. Затем в чашке для культивирования размером 3 1/2 или 6 сантиметров, содержащей 75% этанола, с помощью хирургической иглы насадите каждый язык на кусок хирургического шва. И небольшим кусочком стерильной жестяной фольги оберните конец шва.

В чашке для культур размером 3 1/2 или шесть сантиметров используйте три миллилитра PBS для полоскания каждого языка в течение 30 секунд. Затем в бутылке с широким горлышком приготовьте 90 микрограммов на миллилитр ампициллина в 250 миллилитрах стерильной, сверхчистой воды и добавьте перемешивание. Опустите в бутылку до пяти язычков, пока они не окажутся примерно в двух сантиметрах от дна, и затяните колпачок так, чтобы часть шва осталась снаружи бутылки.

Поместите бутылку на магнитную мешалку на 12 часов. Затем, после инкубации, приготовьте 250 миллилитров 90 микрограмм на миллилитр ампициллина в стерильном одном моляре хлорида натрия. Переложите язычки и перемешанный брусок в бутылку, и закрутите крышку.

Поместите бутылку на магнитную мешалку на 24 часа. Чтобы провести лизис клеток, приготовьте 90 мкг на миллилитр ампициллина в 250 мл стерильного 2%TritonX-100 в PBS. Переложите язычки и перемешивающую планку в бутылку и закрутите крышку.

Затем помешивайте бутылку в течение 48 часов. После приготовления хлорида кальция и хлорида магния с ампициллином переместите салфетку и перемешайте батончик в бутылку и помешивайте бутылку в течение 24 часов. Приготовьте один миллилитр 300 микромолярной ДНКазы в HBSS в одной микроцентрифужной пробирке для каждого образца языка.

Переложите язычки в трубочки, причем такая же часть шва должна свисать наружу. Затем инкубируйте ткани при температуре 37 градусов Цельсия в течение 24 часов. Переложите образцы обратно в бутылку с широким горлышком стерила PBS с ампициллином и поместите ее на мешалку на 24 часа.

После инкубации храните подготовленный внеклеточный матрикс языка, или ПЭМ, в стерильном PBS при температуре четыре градуса Цельсия до использования. Воссоздать статическую модель для семян TSCC от 10 до 10 до шестой одиночных клеток Cal-27 в чашку для культуры размером 3 1/2 сантиметра. Добавьте три миллилитра среды DMEM F12, содержащей 10% FBS, в 90 микрограммов на миллилитр ампициллина и канамицина.

Инкубируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия в течение двух-трех дней до 60% конфлюенции. Затем загрузите ПЭМ на монослой клеток в чашке для культивирования. Выдерживайте блюдо при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа в течение 28 дней.

Обновляйте средство каждый день. Приготовьте самостоятельно изготовленный с перемешиванием мини биореактор, сняв поршень из шприца объемом 10 миллилитров. Сделайте отверстие диаметром один сантиметр возле нижнего конца стержня, и загрузите через отверстие мешалку.

Сделайте еще одно отверстие диаметром полсантиметра в центре крышки бутылки с широким горлышком пластиковой бутылки с широким горлышком, и проденьте шток поршня через крышку. Затем отрежьте половину 50-миллилитровой центрифужной пробирки и приварите ее к внешней стороне крышки бутылки. Прикрепите рыболовные крючки к удилищу, обернув удилище леской, привязанной к крючкам.

Чтобы получить динамическую культуру клеток, засейте в мини-биореакторе от одного раза до 10 до шестой одиночной клетки Cal-27. Добавьте 150 миллилитров среды DF12, содержащей 10% FBS, и по 90 микрограммов на миллилитр ампициллина и канамицина. С помощью крючков, прикрепленных к стержню, загрузите ПЭМ на мини-биореактор, затем закрутите крышку бутылки.

Поместите мини-биореактор на магнитную мешалку в углекислотный инкубатор при температуре 37 градусов Цельсия. Активируйте мини-биореактор при 200 об/мин в течение 7-14 дней. Окрашивание H и E подтвердило, что протокол, продемонстрированный в этом видео, дает ПЭМ с идеальной децеллюляризацией по сравнению с нативными тканями языка с полным исчезновением ядерного окрашивания и лишь редким нарушением целостности ткани при одновременном устранении клеточных компонентов.

На этом рисунке окрашивание H и E показывает, что 3-D восстановление TSCC с использованием TEM и самодельного мини-биореактора привело к получению типичных патологических характеристик TSCC. Клетки в условиях перемешивания демонстрировали миграцию одиночных клеток или коллективную миграцию в различных зонах поражения. В условиях статического культивирования клетки Cal-27 также образовывали инвазивные структуры в ПЭМ, однако это заняло больше времени.

Хотя клетки U2OS могут жить в культуральной среде, они не были обнаружены в ПЭМ, что указывает на то, что ПЭМ биосовместим с определенными типами раковых клеток, и что разные опухолевые клетки нуждаются в различном микроокружении для процветания. Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить, что нужно работать в стерильных условиях. После своего развития этот метод проложил путь исследователям в области рака полости рта к изучению характеристик клеток TSCC в образцах внеклеточного матрикса.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как подготовить клеточный внеклеточный матрикс языка и изготовить модель TSCC in vitro.