Высок объём идентификации наркотиков синергических сочетаний методом дублирования²

Общая цель данной методологии заключается в выявлении синергетических молекул, которые усиливают активность друг друга, при объединении с помощью высокопроизводительного скрининга. Синергетические пары лекарств являются многообещающей стратегией борьбы с лекарственно-устойчивыми инфекциями, но их трудно идентифицировать. Этот метод позволяет идентифицировать молекулы, которые взаимодействуют с существующими противомикробными препаратами, используемыми для лечения инфекционных заболеваний.

В долгосрочной перспективе эти комбинации могут войти в доклиническую оценку и в конечном итоге улучшить уход за пациентами. Основное преимущество этой методики заключается в том, что ее можно проводить с любым интересующим организмом и с любой библиотекой малых молекул. Применение этого метода распространяется на терапию множественных инфекционных заболеваний, поскольку он работает с любым интересующим организмом.

Используйте стандартную таблицу для расчета среднего показателя роста и стандартного отклонения для всех мутантов в присутствии определенной концентрации добавляемой малой молекулы. Затем рассчитайте Z-баллы для каждой концентрации малых молекул. Затем выделите генные мутанты со значительными Z-показателями.

Во-первых, выращивайте культуру E.coli в минимальной среде M9, в течение ночи при 37 градусах Цельсия. Затем растворите мелкие молекулы в диметилсульфоксиде в высокой концентрации выше 10 миллиграммов на миллилитр. Затем добавьте по 100 микролитров среды M9 в каждую лунку в 96-луночной пластине.

Пипетируйте дополнительно 100 микролитров среды М9 в первой колонке так, чтобы объем в этой колонке составлял 200 микролитров. Затем добавьте примерно 10 микролитров концентрированного мелкомолекулярного раствора, в первую колонку. После добавления мелких молекул начните разбавлять его по оси X пластины.

Продолжайте разбавлять до тех пор, пока не останется 100 микролитров в колонке 11. После смешивания в колонке 11 сбросить 100 микролитров из этой колонки. Пусть в столбце 12 есть только среднее значение для нормализации данных.

Затем запишите значение оптической плотности на уровне 600 нанометров культуры, выращенной за ночь в среде с минимальным M9. Затем добавьте по два микролитра культуры в каждую лунку. Такой, чтобы на одну скважину приходилось 1000 ячеек.

Затем осторожно встряхните тарелку. И обратите внимание на показания оптической плотности на 600 нанометрах для нулевого часового времени. После того, как показания будут записаны, инкубируйте планшет при температуре 37 градусов Цельсия в течение суток.

Опять же, измерьте значение оптической плотности на 600 нанометрах в течение 24 часов. Для проведения шахматного анализа выращивайте культуру E.coli в минимальной среде M9 в течение ночи при температуре 37 градусов Цельсия. Затем добавьте по 100 микролитров среды M9 в каждую лунку и добавьте еще 100 микролитров той же среды в первую колонку 96-луночной пластины.

Далее добавляем в тесты малые молекулы, в каждую лунку в один столбец. И добавляем двойную концентрацию в лунку А1. Затем создайте градиент разбавления по оси X, переместив 100 микролитров из первого столбца во второй. Продолжайте процесс разбавления, пока в колонку 100 не будет добавлено 100 микролитров.

После смешивания в колонке 11 сбросить 100 микролитров из этой колонки и оставить в колонке 12 только среду без каких-либо лекарств. Создайте еще один градиент для второго разведения препарата. Для этого добавьте 100 микролитров среды, содержащей два Х, минимальную ингибиторную концентрацию входной молекулы в ряд А. Затем переложите 100 микролитров из ряда А в ряд В. Продолжайте процесс разбавления, пока в ряд Г не будет добавлено 100 микролитров

Затем завивайте в тарелку по два микролитра культуры в каждую лунку. Такой, чтобы на одну скважину приходилось 1000 ячеек. Затем измерьте показания оптической плотности на 600 нанометрах для нулевой часовой временной точки.

После того, как показания будут записаны, инкубируйте планшет при температуре 37 градусов Цельсия в течение 24 часов. Затем измерьте значение оптической плотности на 600 нанометрах в течение 24 часов. Для проведения высокопроизводительного скрининга для синергических препаратов культивируют мутантные клетки как дикого типа, так и мутантные клетки, предсказывающие синергию, в минимальной среде М9.

Затем добавьте лекарства из библиотеки в носитель. Затем привите одну пластину библиотечных препаратов дикого типа и еще одну пластину с мутантными бактериями с предсказанием синергии. Эта пластина представляет собой шахматный анализ, используемый для исследования синергетических комбинаций лекарств.

На этой пластине скважина F9 с самым низким показателем FICI 0,07 указывает на то, что пара малых молекул является синергетической. Эта пластина представляет собой шахматный анализ для исследования невзаимодействующей комбинации лекарств. В этой пластине лунка С3 с самым низким показателем FICI 1,0 указывает на то, что пара малых молекул не взаимодействует друг с другом.

Эта табличка представляет собой шахматный анализ, используемый для исследования антагонистических комбинаций лекарств. На этой пластине скважина А1 с самым низким баллом FICI 8,0 указывает на то, что взаимодействие между молекулами лекарственного препарата является антагонистическим. Далее Бефельдин А, низкомолекулярный препарат в составе флуконазола, используется для изучения роста форм С и U.

График показывает, что рост как дикого типа, так и мутанта предсказания синергии подавляется незначительно и в одинаковой степени. Это указывает на то, что Бефельдин А и Флуконазол являются несинергическими партнерами по препаратам. Напротив, рост мутанта прогнозирования синергии С и U форминов значительно ингибируется в присутствии Рефромизина и Флуконазола.

Указание на то, что препараты являются синергетическими партнерами. Интересно, что рост дикого типа нисколько не тормозится. Здесь наибольшая разница в росте наблюдается между 32 и 49 часами после прививки.

После освоения этой методики можно сократить время выявления синергетических лекарственных взаимодействий. При проведении этой процедуры важно помнить, что нельзя объединять препараты в последней колонке в последней строке шахматного анализа. После этой процедуры могут быть выполнены другие методы идентификации синергических молекул с целью выявления дополнительных синергических взаимодействий лекарственных средств.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как использовать методологию O2M для выявления предполагаемых маркеров синергии с целью поиска синергетических лекарственных взаимодействий с интересующим вас организмом. Не забывайте, что при работе с некоторыми малыми молекулами может быть опасно и любые меры предосторожности в MSDS, следует соблюдать при выполнении этого протокола.