Выделение и характеристика сердечной мезенхимальных стромальных клеток от эндомиокардиальная относящийся к биопсии образцы больных аритмогенная кардиомиопатия

Общие цели этого протокола заключаются в выделении мезенхимальных стромальных клеток сердца у пациентов с аритмогенной кардиомиопатией, проверке их способности к адипогенной дифференцировке и фенотипировании их поверхностных маркеров. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области аритмогенной кардиомиопатии, такие как участие сердечных стромальных клеток в адипозамещении, и подчеркнуть молекулярные механизмы. Основное преимущество этого метода заключается в том, что выделение клеток стомы может быть выполнено с помощью нескольких простых пассажей из очень маленьких образцов сердца.

Тем не менее, этот метод может дать представление об изучении аритмогенной кардиомиопатии. Он также может быть применен к другим системам, таким как исследование сердечно-сосудистых заболеваний, при которых показана эндомиокардиальная биопсия. Впервые мы изучили идею этого метода, когда поняли, что можем уменьшить масштаб процедуры выделения клеток стомы, чтобы применить ее к биопсии сердца и электрофизиологии, которую она может нам предоставить.

Для этого протокола необходимо провести эндомиокардиальную биопсию из правого желудочка пациента с АКМП с использованием интегрированного электроанатомического картирования и рентгеноскопии сердца. Возьмите около пяти граммов ткани и отправьте ее в лабораторию в среде TMES. В лаборатории установите шкаф биологической безопасности по мере необходимости для проведения процедуры вплоть до энсоматического разложения.

Затем перенесите биопсию в тарелку и дважды промойте ее PBS. На этом этапе биопсия может быть сфотографирована под микроскопом. Затем перенесите биопсию в двухмиллилитровую пробирку, содержащую один миллилитр раствора коллагеназы.

В нем разрежьте образец на мелкие фрагменты шириной от 0,5 до одного миллиметра. Затем инкубируйте ткань в течение 90 минут при температуре 37 градусов Цельсия при непрерывном вращающемся перемешивании. Далее центрифугируйте сваренный раствор, удалите надосадочную жидкость, и повторно суспендируйте гранулу в одном миллилитре PBS.

Затем снова центрифугируйте пробирку, удалите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу в одном миллилитре TMES. Теперь накладываем суспензию на 60 миллиметровую пластину и заполняем пластину до трех миллилитров с помощью ТМЕС, но не дальше. Затем культивируют и расширяют клетки согласно текстовому протоколу.

Прежде чем начать, подготовьте реагент для диссоциации клеток, промывочный буфер и необходимые антитела. Когда расчетное количество клеток культуры достигнет трех миллионов, промойте 100-миллиметровую пластину дважды 10 миллилитрами стерильного PBS. Затем добавьте в клетки пять миллилитров реагента для диссоциации клеток и инкубируйте планшет в течение 7-10 минут при комнатной температуре, чтобы отделить клетки.

Как только клетки будут отделены, добавьте в клетки 15 миллилитров PBS и переложите суспензию в 50-миллилитровую трубку. Теперь центрифугируйте ячейки и повторно суспендируйте гранулу в одном миллилитре промывочного буфера. Затем пересчитайте ячейки и переложите три миллиона в новую пробирку в итоговом объеме 1,5 миллилитра промывочного буфера.

Далее разделите суспензию на 12 факсимильных трубок. В каждую пробирку добавьте антитела, используемые для определения характеристик CMSC в рекомендуемых концентрациях. Обязательно включите элементы управления изотипами.

После приготовления выдержите трубки в течение 15 минут при комнатной температуре, защищенные от света. Позже добавьте по одному миллилитру промывочного буфера в каждую пробирку, чтобы остановить реакции. Затем центрифугируйте ячейки, удалите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулы в 250 микролитрах промывочного буфера.

Теперь приступаем к характеристике клеток с помощью проточной цитометрии. После адипогенной дифференцировки клеток используйте окрашивание ORO для проверки накопления липидов. Перед началом работы убедитесь, что у вас есть рабочий раствор ORO.

Перед окрашиванием клеток удалите среду и дважды промойте клетки двумя миллилитрами PBS. Затем покройте клетки 4%-ным параформальдегидом и дайте им закрепиться в течение пяти минут при комнатной температуре. Далее выбросьте параформальдегид и дважды промойте клетки двумя миллилитрами PBS.

После второй промывки добавьте достаточное количество рабочего раствора ОРО, чтобы покрыть клетки. Затем выдержите тарелку в течение часа при комнатной температуре. Эту инкубацию необходимо проводить в условиях, где автораствор не будет работать, поэтому не рекомендуется использовать полные помещения.

После инкубации отасканируйте раствор ОРО и промойте клетки двумя миллилитрами PBS несколько раз до тех пор, пока пятно не станет заметным при смыве PBS и до тех пор, пока при рассмотрении под микроскопом не будет обнаружено неспецифическое окрашивание. Теперь, используя инвертированный фазовый контрастный микроскоп для культуры тканей, сделайте 20 изображений каждой лунки при 20-кратном увеличении. Подробности указаны в текстовом протоколе.

CMSC были выделены из эндомиокардиальной биопсии, как описано. Чтобы подтвердить их мезенхимальную линию, клетки инкубировали с соответствующими флоронашими конъюгированными антителами и анализировали с помощью проточной цитометрии. CMSC были положительными на специфические мезенхимальные поверхностные антигены CD29, CD44 и CD105.

Известно, что фракция CD90-положительных клеток вариабельна. Маркеры эндотелиального наследия, моноцитарного или макрофагального наследия, ономатопоэтического наследия и главного комплекса гистосовместимости не экспрессировались. Затем CMSC культивировали в среде T.ADIPO для адипогенной дифференцировки и окрашивали ORO для поиска внутриклеточных липидных капель.

КМСК пациентов с аритмогенной кардиомиопатией накапливали больше липидных капель, чем клетки здоровой контрольной группы. Эти различия были измерены в условиях дифференциации через 72 часа и через семь дней. После освоения разрешение ячейки может быть выполнено за три часа, окрашивание может быть выполнено за два часа, а анализ факса может быть завершен за три часа.

После этой процедуры могут быть использованы другие методы, такие как тестирование на наркотики, чтобы ответить на дополнительные вопросы, например, можем ли мы использовать клетки стомы от одних и тех же пациентов, реагирующих на различные стимулы. После своего развития этот метод проложил путь исследователям в области аритмогенной кардиомиопатии для изучения участия клеток сердечной стромы человека в патогенезе заболевания.