Стереотаксической хирургии для генетических манипуляций в полосатой клеток мозга новорожденных мыши

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы генетического и неврологического развития, например, в период постнатального развития. Главное преимущество этой методики в том, что она представляет собой простую технику с самодельным устройством. Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, потому что проведение целенаправленных инъекций в мозг требует полного внимания к деталям.

Для начала изготовьте держатель для использования новорожденных щенков в стереотаксическом аппарате. Сначала сделайте головной лоток. Отрежьте около 1/5 части дна центрифуги объемом 1,5 миллилитров, чтобы сделать отверстие для головы новорожденного щенка.

Далее выберите пустую коробку для наконечника для пипетки, которая подходит к пьедесталу стереотаксического аппарата. Затем с помощью горячего клея закрепите головной лоток к основанию коробки для чаевых. Затем приклейте кассету для встраивания тканей на коробку, где она сможет поддерживать туловище щенка, пока его голова неподвижна.

Теперь подготовьте иглы из нержавеющей стали 30 калибра для инъекции. Во-первых, предварительно очистите их, замочив в хлороформе на три дня в стеклянном флаконе. Через три дня осторожно извлеките иглы и промойте их абсолютным этанолом в течение 20 минут и при 50 оборотах в минуту перемешивания.

Затем промойте их три раза в 70%-ном этаноле в течение 10 минут за одну стирку, также с перемешиванием. После стирки дайте иглам высохнуть на воздухе и храните их в чистой коробке при комнатной температуре до использования. Для узла микровпрыска используйте пятисантиметровый сегмент полиэтиленовой трубки PE20, чтобы соединить трубку PE10 со шприцем 26 калибра объемом 10 микролитров.

Закрепите место соединения цианоакрилатом. Затем установите новую инъекционную иглу 30 калибра на другой конец трубки PE10. Теперь загрузите шприц для микроинъекций объемом 10 микролитров.

Снимите поршень и с помощью другого шприца 25 калибра загрузите сборку автоклавной дистиллированной водой для удаления воздуха из трубки. Затем поместите поршень обратно в микролитровый шприц и нажимайте на поршень до тех пор, пока в бочке не останется всего два микролитра дистиллированной воды и не меньше. Затем аккуратно установите микролитровый шприц на шприцевой насос микропотока.

Затем пипеткой нанесите небольшое количество отфильтрованного 0,1%-ного зеленого красителя в экспериментальной вирусной жидкости на кусок парапленки. Теперь втяните небольшое количество воздуха в шприц до тех пор, пока между иглой для инъекции и трубкой не станет виден пузырь воздуха. Затем загрузите 0,7 микролитра отфильтрованного раствора Fast Green для проверки потока жидкости в трубке для микровпрыска.

Если поток хороший, то отсасывайте еще один небольшой объем воздуха, чтобы создать второй пузырь воздуха, а затем загружайте раствор для впрыска в трубку для микровпрыска. Прикрепите и закрепите иглу для микроинъекций к стереотаксическому аппарату и приступайте к микроинъекции неонатальным мышам. При подготовке к операции тщательно протрите стереотаксический инструмент 70% этанолом и простерилизуйте хирургические инструменты 70% этанолом.

Затем обезболить новорожденного с помощью гипотермии. Поместите щенка в латексную перчатку и погрузите его в колотый лед по шею на пять минут. Затем ущипните ноги щенка щипцами, чтобы убедиться в отсутствии педального рефлекса.

Затем поместите щенка с перчаткой в лоток для головы и насыпьте немного колотого льда вокруг латексного рукава, чтобы сохранить анестезию от гипотермии. Затем потрите голову щенка 70% этанолом и найдите ориентир для лямбды. Отметьте его маркером.

Затем направьте кончик иглы на лямбду и установите передние/задние и медиальные/латеральные координаты на ноль. Затем, сверившись с атласом мозга, переместите руку для инъекции к целевому участку. Например, стриатум у щенков P2 находится на 2,4 миллиметра впереди лямбды, на 1,0 миллиметра по обе стороны от средней линии и на 1,7 миллиметра вентрально.

Далее отметьте положение красителя Fast Green на пробирке PE10 с помощью ручки. Затем медленно начинайте проникать иглой через кожу и череп до тех пор, пока кончик иглы не коснется поверхности черепа. Установите координату дорсальной/вентральной координаты равной нулю.

Затем медленно опустите иглу к целевому месту. Оказавшись на месте, подождите одну минуту, чтобы паренхима вернулась к своей нормальной форме. Затем запустите программу микровпрыска со скоростью 100 нанолитров в минуту.

Во время инъекции наблюдайте за движением красителя Fast Green в полиэтиленовой трубке. Крайне важно медленно вводить иглу через кожу и череп до тех пор, пока кончик иглы не коснется поверхности черепа. Во время инъекции крайне важно следить за движением красителя Fast Green в полиэтиленовой трубке.

После того, как инъекция будет завершена, подождите одну минуту, а затем медленно поднимите иглу на 1/2 глубины проникновения DV. Затем подождите еще 30 секунд, прежде чем приступить к медленному извлечению иглы из головы щенка. После завершения инъекции важно подождать одну минуту, прежде чем медленно вводить иглу на 1/2 глубины проникновения DV.

Затем подождите еще 30 секунд, прежде чем медленно вытащить иглу из головы щенка. После того, как все целевые участки будут введены, прогрейте щенка в течение 20 минут в инкубаторе с температурой 33 градуса Цельсия. Проверяйте щенка каждые пять минут, пока он не восстановит лежачее положение на грудине.

200 нанолитров вируса, экспрессирующего рекомбиназу Cre ДНК, слитую с GFP, были введены в стриатум P2 мышей Ai14. Эти мыши экспрессировали репортерный ген tdTomato при Cre-опосредованной делеции фланкированной стоп-кассеты loxP.

Мозг был собран на уровне P14 для иммуноокрашивания GFP и tdTomato. Многие GFP-позитивные клетки, трансдуцированные AAV, присутствовали по всему стриатуму, что указывает на обширное инфицирование клеток стриатального тела вирусами AAV EGFP Cre. Аналогичная экстенсивная экспрессия tdTomato была обнаружена и в полосатом теле.

При микроскопическом исследовании при большом увеличении было обнаружено, что все GFP-положительные стриарные клетки коэкспрессируют репортерный ген tdTomato. Кроме того, сигналы tdTomato были обнаружены в предположительно окончаниях аксонов в бледном шаре, в черной субстанции pars reticulata, областях-мишенях стриатонигральных и стриатопаллидальных проекционных нейронов. В совокупности эти результаты свидетельствуют об успешной рекомбинации ДНК, опосредованной Cre loxP, индуцированной AAV-опосредованной экспрессией активности Cre в неонатальных нейронах стриарного тела.

После освоения этой техники ее можно сделать за 30 минут для двусторонней инъекции стриарального тела, если она выполнена правильно. Пытаясь провести эту процедуру, важно помнить, что это деликатная неонатальная операция на головном мозге, которая требует терпения и осторожности. На основе этой процедуры могут быть использованы другие методы, такие как оптогенетика и хемогенетика, чтобы проанализировать созревание во время постнатального развития.