Изоляция лимфоциты от мыши небольшой кишечной иммунной системы

Общая цель этого протокола заключается в выделении лимфоцитов из индуктивных участков кишечника, включая пейеровы пятна и брыжеечные лимфатические узлы, и эффекторных участков, включая собственно пластинку и эпителий. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области иммунологии слизистых оболочек, такие как понимание иммунных реакций на желудочно-кишечные инфекции, рак и воспалительные заболевания. Основное преимущество этой методики заключается в том, что она обеспечивает выделение высокоочищенных и жизнеспособных лимфоцитов из отдельных отделов тонкой кишки с минимальным перекрестным загрязнением.

Как правило, люди, плохо знакомые с этим методом, испытывают трудности, потому что сложно идентифицировать и изолировать брыжеечные лимфатические узлы и пятна Пейера, а также сбалансировать скорость и точность для достижения оптимальных результатов. Чтобы начать протокол, положите ранее обезболенную мышь на спину и распылите на нее 70% этанола. С помощью ножниц сделайте разрез по средней линии и откройте кожу и брюшную стенку, чтобы обнажить брюшную полость.

Затем найдите слепую кишку и с помощью щипцов аккуратно потяните слепую кишку. С помощью щипцов осторожно переместите тонкую кишку вправо, обнажив весь брыжеечный лимфатический узел или цепь MLN, которая выровнена с толстой кишкой. Определите нижний узел в цепочке, расположенный ближе всего к слепой кишке.

Используйте один набор щипцов, чтобы захватить брыжеечный жир вокруг него, и осторожно переместите цепь MLN снизу вверх, выщипывая жир вокруг лимфатического узла другим набором щипцов. Затем смочите полотенце с материалом для уборки и постелите цепочку МЛН на бумажное полотенце. Удалите жир брыжейки, прокатав цепочку по бумажному полотенцу и стянув жир с помощью двух наборов щипцов.

Поместите MLN в холодный фильтрующий материал для последующей изоляции. Ножницами разрежьте тонкую кишку ниже пилорического сфинктера и выше слепой кишки. Медленно вытяните кишечник от подвздошной кишки к двенадцатиперстной кишке с помощью одного набора щипцов, одновременно удаляя прикрепленный брыжеечный жир с помощью другого набора щипцов.

Положите кишечник на бумажное полотенце, смоченное в среде для сбора урожая, и сотрите оставшийся жир брыжейки с помощью двух наборов щипцов. Поддерживайте кишечник увлажненным на протяжении всех этих этапов, периодически применяя заготовленную среду. Соберите пейеровы пластыри, удалив их из кишечника изогнутыми ножницами.

Соберите 5-11 пластырей Пейера из тонкой кишки. Поместите грядки Пейера в холодную среду для сбора урожая для последующих этапов изоляции. Используйте плоскую сторону щипцов и осторожно скользите от двенадцатиперстной кишки к подвздошной кишке, чтобы удалить кал и слизь.

Повторите этот шаг один раз, чтобы удалить большую часть слизи. Используйте тонкие ножницы с тупым концом в одну точку, введите тупой конец в кишечник и разрежьте кишечник в продольном направлении от двенадцатиперстной кишки до подвздошной кишки. Вскрытую кишку разрезаем с боков на два сантиметра кусочка.

Поместите кусочки кишечника в коническую пробирку объемом 50 миллилитров с 25 миллилитровыми холодными средами для последующего выделения. Выделите лимфоциты из МЛН, аккуратно диссоциировав их через клеточный фильтр с толщиной 70 мкм с помощью поршня трехмиллилитрового шприца. Промойте сетчатое фильтр ячейки пятью миллилитрами холодного материала для сбора урожая.

Гранулируйте ячейки MLN, центрифугируя их при 400-кратной гравитации в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия. Затем повторно суспендируйте клеточную гранулу в одном миллилитре холодной среды для уборки. Промойте кусочки тонкой кишки три раза 25 миллилитрами холодного материала, перевернув трубку 10 раз.

Дайте кусочкам кишечника осесть и слейте надосадочную жидкость. Далее добавьте 20 миллилитров предварительно подогретого раствора дитиоэритритола или DTE в 50 миллилитровую коническую трубку, содержащую кусочки кишечника, и переложите содержимое в 50-миллилитровую силиконизированную колбу Эрленмейера с помощью мешалки. Используйте большой магнит на внешней стороне колбы, чтобы удерживать мешалку и перенести салфетку и раствор обратно в 50-миллилитровую коническую трубку.

трубку на максимальной настройке в течение 10 секунд. Перенесите надосадочную жидкость в новую коническую пробирку объемом 50 миллилитров через клеточный фильтр 70 микрометров, стараясь сохранить кусочки ткани в исходной пробирке. Гранулируем клетки.

Ресуспендируйте клеточную гранулу в 10 миллилитров холодной среды и храните на льду. Добавьте 20 миллилитров предварительно подогретого раствора DTE в 50-миллилитровую коническую трубку, содержащую кусочки кишечника, и переложите обратно в 50-миллилитровую силиконизированную колбу Эрленмейера, содержащую мешалку. Используйте большой магнит на внешней стороне колбы, чтобы удерживать мешалку и перенести салфетку и раствор обратно в 50-миллилитровую коническую трубку.

Поверните трубку на максимальную настройку в течение 10 секунд. Перенесите надосадочную жидкость через сетчатый фильтр 70 микрометров в пробирку, содержащую клетки из надосадочной жидкости первой обработки DTE, и центрифугируйте клетки. Ресуспендируйте клеточную гранулу в восьми миллилитрах 44% градиента плотности или растворе DG при комнатной температуре.

Перелейте восьмимиллилитровый раствор 44% DG и клеточную суспензию в полипропиленовую трубку с круглым дном размером 17 на 100 миллиметров 14 миллилитров. Подложите ячейки пятью миллилитрами раствора RT 67%DG. Центрифугируйте при 1,600-кратном течении силы тяжести в течение 25 минут при RT без использования тормоза.

Жизнеспособные клетки образуют охристую оболочку на границе 44% и 67%. Сверху снимите жировую прослойку с помощью вакуумной аспирации. С помощью пастеровской пипетки соберите охристую оболочку на границе раздела и перенесите в коническую пробирку объемом 50 миллилитров, содержащую 40 миллилитров среды для холодного сбора.

Пеллетные ячейки центрифугируют при 400-кратном весе тяжести в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия и ресуспендируют клеточную гранулу в одном миллилитре холодной среды. Удалите эпителиальные клетки из кусочков кишечной ткани, добавив 25 миллилитров предварительно подогретого раствора ЭДТА к оставшимся кишечным кусочкам, и переложите содержимое в 50-миллилитровую силиконизированную колбу Эрленмейера с помощью мешалки и перемешайте. Держите мешалку и осторожно выбросьте надосадочную жидкость, сохраняя кишечные кусочки в колбе.

Повторите этап удаления эпителиальных клеток еще раз. Далее добавьте 50 миллилитров среды комнатной температуры и кратковременно перемешайте содержимое с помощью магнита. Затем дайте кусочкам кишечника осесть и аккуратно выбросьте надосадочную жидкость.

Добавьте 30 миллилитров подогретого раствора коллагеназы и размешайте кусочки кишечника. После перемешивания перенесите переваренную ткань и надосадочную жидкость в коническую трубку объемом 50 миллилитров через клеточное ситечко 70 микрометров. Аккуратно диссоциируйте оставшиеся кусочки ткани, используя поршень трехмиллилитрового шприца для протирания через фильтр.

Промойте фильтр 10 миллилитрами холодного материала и гранулируйте ячейки. После отжима повторно суспендируйте клеточную гранулу в восьми миллилитрах окружающей среды 44%-ного раствора DG. Перелейте восемь миллилитров суспензии 44%-ного раствора DG в свежую полипропиленовую трубку с круглым дном размером 70 на 100 миллиметров.

Подложите пятью миллилитрами раствора 67% DG температуры окружающей среды, затем центрифугируйте градиенты. Сверху снимите жировую прослойку с помощью вакуумной аспирации. С помощью пастеровской пипетки соберите охристую оболочку на границе раздела и перенесите в коническую пробирку объемом 50 миллилитров, содержащую 40 миллилитров среды для холодного сбора.

Наконец, повторно суспендируйте клеточную гранулу в одном миллилитре холодной среды для сбора урожая. Каждый кишечный иммунный компартмент характеризуется уникальным составом субпопуляций лимфоцитов. MLN преимущественно состоит из альфа-бета Т-клеток, в то время как PP-лимфоциты в основном состоят из В-клеток.

Состав лимфоцитов LP в основном состоит из альфа-бета Т-клеток и В-клеток. IEL в основном представляют собой гамма-дельта Т-клетки и альфа-бета Т-клетки, практически не содержащие В-клеток. CD8 альфа положительные альфа бета Т клетки в компартментах LP и IEL экспрессировали CD8 альфа гомодимер или CD8 альфа бета гетеродимер, в то время как индуктивный сайт CD8 альфа позитивные альфа бета Т клетки преимущественно экспрессировали CD8 альфа бета гетеродимер.

Большинство гамма-дельта Т-клеток в компартменте IEL экспрессировали CD8 альфа, в то время как гамма-дельта Т-клетки, обнаруженные в MLN, не имеют CD8 альфа. Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить о том, что необходимо уделять достаточно времени и осторожности во время этапов изоляции тканей, чтобы ограничить загрязнение между кишечными компартментами. После этой процедуры изолированные лимфоциты могут быть подвергнуты стимуляции ex vivo, проточной цитометрии и другим методам для дальнейшего фенотипического и функционального анализа.