Подготовка мышиных подчелюстной слюнной железы вертикально прижизненной микроскопии

Общей целью этой хирургической процедуры является подготовка подчелюстной слюнной железы мыши к вертикальной прижизненной микроскопии. Этот метод может помочь ответить на вопросы в любой области исследований, где подчелюстная слюнная железа используется в качестве модельного органа, например, в иммунологии. Основное преимущество данной методики заключается в том, что она позволяет проводить хирургическую подготовку слюнной железы для вертикальной прижизненной микроскопии, которая широко применяется в области иммунологии.

Во-первых, используйте электрическую бритву, чтобы удалить шерсть с области бритья на мыши C57 black six. Затем промокните ватный тампон кремом для эпиляции и нанесите его на выбритый участок. Примерно через три минуты влажными салфетками тщательно удалите крем с выбритого участка.

Далее снимаем держатели для нагревательного кольца и съемный держатель покровного стекла, чтобы подготовить сцену для фиксации мыши. Затем ослабьте винты ушного вкладыша и неподвижных держателей покровного стекла. Далее прикрепите скотчем кусок марли к центру сцены, чтобы подготовить подстилку для мыши.

С помощью клея прикрепите покровное стекло диаметром 20 мм к верхней части цилиндрического металлического держателя, образующего нижнее покровное стекло. Затем приклейте 25-миллиметровое покровное стекло к нижней части плоского металлического держателя, образующего верхнее покровное стекло. Далее расположите мышь спиной к марле перпендикулярно натянутой веревке, а голову по центру между ушными планками.

Далее с помощью хирургической ленты фиксируем верхнюю часть мыши на сцене. Затем зацепите шнурок за верхние передние резцы, затягивая шнурок до тех пор, пока челюсть не достигнет горизонтального положения. Далее с помощью изогнутых под углом щипцов осторожно вытяните язык, чтобы обеспечить дыхание.

Затем плотно натяните хвост и прикрепите его скотчем к сцене. Затем выровняйте ушные планки таким образом, чтобы между планкой на краю сцены образовался угол примерно 30 градусов. Для этого нарисуйте на листе бумаги два угла вправо и влево по 30 градусов.

Затем расположите прозрачный предметный столик на бумаге, чтобы выровнять держатели. Продолжайте одновременно перемещать левый и правый стержни внутрь, чтобы зафиксировать губки в неподвижном положении, а затем затяните винт. Следите за движением грудной клетки до, во время и после фиксации челюсти.

Поставьте рядом нагревательную лампу или грелку под сценой, чтобы нагреть мышь. Во-первых, попытайтесь обнаружить небольшую выпуклость на коже, чтобы определить правую подчелюстную слюнную железу. Затем с помощью тонких щипцов приподнимают кожную складку в центре выпуклости и создают разрез длиной примерно пять миллиметров.

Затем с помощью шприца с иглой для подкожных инъекций 25 калибра, заполненной вакуумной смазкой, нанесите кольцо вакуумной смазки высотой четыре миллиметра вдоль поверхности разреза. Заполните жирное кольцо солевым раствором, чтобы оставить ткань влажной. Затем сядьте под стереомикроскоп и с помощью одного щипца прочно удерживайте соединительную ткань, соединенную с железой, а другим щипцом оттяните дистальный отдел соединительной ткани для ее разрыва.

Продолжайте разрушать соединительную ткань в верхней части железы, а затем в медиальном отделе. Затем удалите боковую соединительную ткань против часовой стрелки вокруг железы от медиального до рострального отдела. Новички обычно больше всего борются с разрушением соединительной ткани, окружающей железу, без повреждения самой железы.

Затем с помощью щипцов вытяните прикрепленную к железе соединительную ткань вверх, чтобы приподнять каудальную часть железы. Затем разрушьте соединительную ткань ниже подчелюстной доли от каудального к ростральному концу. Убедившись в отсутствии утечки из смазочного кольца, расположите нижнее покровное стекло, прикрепленное к металлической планке, к ее регулируемому по высоте держателю.

Поддерживайте угол наклона мыши в 60 градусов, располагая держатель от каудального направления. Затем опустите покровное стекло, чтобы оно соприкоснулось с сальником. Заполните кольцо для смазки в верхней части покровного стекла, чтобы образовался новый резервуар для солевого раствора.

Далее с помощью щипцов аккуратно перещипните соединительную ткань, прикрепленную к подчелюстной доле и натяните ее поверх покровного стекла. Поддерживайте смазочное кольцо на высоте четырех миллиметров во избежание утечки. Убедитесь, что держатель покровного стекла для верхнего покровного стекла находится в своем верхнем положении.

Затем с помощью винта прикрепите металлический стержень с верхним верхним стеклом 25 миллиметров к держателю. Чтобы расположить подчелюстную железу в центре, с помощью регулируемых винтов держателя установите покровное стекло. С помощью винтов регулируемого держателя опустите верхнее защитное стекло, чтобы коснуться подчелюстной железы.

Затем обратите внимание на форму и цвет железы. Затем обратите внимание на возможные пузырьки воздуха или капли физиологического раствора за пределами резервуара, чтобы исключить утечку. Затем затяните все крепежные винты.

При обычном использовании этого протокола критическим шагом является регулировка покровного стекла и смазки таким образом, чтобы сформировать идеальную камеру уплотнения без слишком сильного или слишком слабого давления на слюнную железу. Затем вставьте температурный щуп внутрь резервуара так, чтобы он находился близко к сальнику, и прикрепите провод зонда к столику. Расположив подчелюстную железу в центре, нанесите смазочное кольцо на верхнюю покровную крышку.

Затем поместите нагревательное кольцо на верхнюю часть покровного стекла и запечатайте его смазкой. Наконец, прикрепите трубку нагревательного кольца к сцене. Здесь продемонстрирована сосудистая сеть подчелюстной железы и фибробластоподобных клеток, экспрессирующих репортерный зеленый флуоресцентный белок COL1A1.

На флуоресцентном изображении кровеносные сосуды помечаются путем внутривенного введения конъюгата техасского красного декстрана, в то время как фибриллярный коллаген, присутствующий между двумя долями, может быть обнаружен как второй гармонический сигнал. На этом изображении просвет протока помечен Cascade Blue Dextran после введения его в проток Уортона, а также видны зеленые флуоресцентные белки-метки CD8-положительными Т-клетками, что указывает на присутствие Т-клеток в слюнных железах мышей. Это последовательности CD8-положительных Т-клеток памяти с тегом GFP.

Эти CD8-положительные Т-клетки мигрируют в подчелюстную слюнную железу. Кровеносные сосуды в железе помечаются путем внутривенного введения техасского красного декстрана, а ядра клеток окрашиваются методом Хёхста. После освоения этой техники ее можно выполнить за 30-40 минут при правильном выполнении.

Во время этой процедуры важно регулярно контролировать жизненно важные показатели мыши и анестезию. Эта процедура может быть использована в сочетании со многими другими методами, такими как адоптивный перенос флуоресцентно меченых иммунных клеток, чтобы ответить на дополнительные вопросы, такие как миграция иммунных клеток в паренхиме слюнных желез. Этот метод проложил путь исследователям в области иммунологии к изучению миграции Т-клеток памяти в тканях в слюнной железе.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как хирургически подготовить подчелюстную слюнную железу к вертикальной прижизненной микроскопии.