Изоляции и в пробирке культуры мышиных и человека альвеолярные макрофаги

Общая цель этой процедуры заключается в выделении альвеолярных макрофагов человека и мышей из легких и жидкости бронхоальвеолярного лаважа и разработке метода их культивирования in vitro. Этот метод может помочь ответить на некоторые ключевые вопросы в области пульмоноиммунологии, такие как роль альвеолярных макрофагов в респираторных инфекциях, воспалении и аутоиммунитете. Основное преимущество этой методики заключается в том, что можно отличить альвеолярные макрофаги от других лейкоцитов легких и получить популяцию высокоочищенных альвеолярных макрофагов для экспериментальных целей.

Поместите мышь под наркозом на поверхность для рассечения брюшной стороной вверх. Нанесите офтальмовизуальную ветеринарную мазь на глаза, чтобы предотвратить обезвоживание. Протрите всю брюшную поверхность мыши стерильными спиртовыми салфетками, пропитанными 70% изопропанолом, для дезинфекции.

Установите мышь с удержанными всеми четырьмя ножками. Аккуратно вскройте брюшную полость с помощью инструментов для микродиссекции. Необходимо позаботиться о том, чтобы открыть как можно большую площадь, не повреждая висцеральные органы и не создавая нависающих тканей.

Аккуратно откройте грудную полость, медленно разрезая грудную клетку через средостение. В идеале грудная клетка может быть иссечена из стороны в сторону. Необходимо соблюдать крайнюю осторожность, чтобы не повредить плевру легких при вскрытии грудной полости.

Найдите нижнюю полую вену и сделайте разрез, чтобы обескровить мышь. Используйте впитывающие ватные диски, чтобы впитать кровь. Введите 10 миллилитров ледяного фосфатного буферного раствора в правый желудочек для промывания циркулирующих клеток крови.

Впитайте поток крови с помощью впитывающих ватных дисков. После полной перфузии легкие будут выглядеть бледными и будут готовы к промыванию. Аккуратно разрежьте кожу и мышцы шеи, чтобы обнажить дыхательные пути.

Аккуратно иссекайте прилегающие мышцы, хрящи и жировые ткани, не повреждая трахею. Далее сделайте небольшой разрез на трахее, позади гортани. Этого разреза должно быть достаточно, чтобы вставить катетер, пока трахея все еще прикреплена к гортани.

Самым важным этапом сбора жидкости BAL является надежное прикрепление катетера к трахее, что сведет к минимуму утечки во время промывания. Введите катетер диаметром один дюйм 22 калибра без иглы в трахею по направлению к легким. Закрепите катетер шелковым плетеным швом и квадратным узлом.

Имея крепкие руки и выполняя этот шаг, медленно и мягко предотвратите разрыв трахеи и легких. Подсоедините к катетеру одномиллилитровый шприц, наполненный ледяным буфером BAL, и медленно закапывайте буфер в легкие. Это приведет к раздуванию легких.

Держите шприц прикрепленным к катетеру в течение пяти секунд, а затем отсасывайте жидкость для промывания, осторожно потянув за поршень. Это приведет к сдуванию легких. Соберите жидкость в коническую трубку объемом 15 миллилитров, положите на лед.

Повторите надувание и сдувание еще девять раз и слейте жидкость для промывания. Не превышайте одного миллилитра буфера на одну промывку, так как это может превысить емкость легких и привести к их разрыву. Центрифугируйте 10 миллилитров жидкости BAL при 250 умноженных на g и четырех градусах Цельсия в течение 10 минут.

Клеточная гранула содержит клетки BAL. Ресуспендируйте ячейки BAL в 100 микролитрах буфера для сортировки в потоке. Приступайте к окрашиванию и сортировке ячеек, как описано в текстовом протоколе.

Подготовьте мышь под наркозом к вскрытию, выполните разрезы и обескровите мышь, как и раньше. Введите 10 миллилитров ледяного PBS в правый желудочек, чтобы промыть циркулирующие клетки крови. После полной перфузии легкие будут выглядеть бледными и готовыми к сбору.

Рассеките легкие, разрезав трахею, кровеносные сосуды и связки в коническую трубку объемом 15 миллилитров с пятью миллилитрами холодного DMEM. Держите его на льду до следующего шага. Перенесите перфузированные легкие в стерильную и не содержащую пирогена 60-миллиметровую чашку для культивирования с тремя миллилитрами DMEM.

С помощью рассекающих щипцов вытащите дыхательные пути и другой твердый материал, не относящийся к легочной ткани, если он присутствует. Измельчите легочную ткань скальпелем до размера менее одного миллиметра. Добавьте 300 микрограммов на миллилитр Liberase TL и пять единиц на миллилитр DNAse one.

Перемешайте с помощью пипетки и инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия в инкубаторе в течение 25 минут. Через 10 минут аккуратно перемешайте один раз с помощью пипетирования. Пропустите диссоциированные легкие через клеточный фильтр 100 микрон, установленный на конической трубке объемом 50 миллилитров.

Используйте заднюю часть поршня от одномиллилитрового шприца, чтобы размять комки клеток на фильтре. Промойте фильтр 20 миллилитрами буфера для промывки. Центрифугируйте при 500 умноженных на g и четырех градусах Цельсия в течение пяти минут.

Выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клеточную гранулу в 20 миллилитрах буфера для стирки. Повторите этапы процеживания и центрифугирования дважды, каждый раз меняя фильтр и трубку. Наконец, приготовьте суспензию для одиночных клеток, добавив 100 микролитров буфера для сортировки по потоку в клеточную гранулу.

Выполните окрашивание антител и сортировку клеток, как описано в текстовом протоколе. После сортировки клеток соберите их путем центрифугирования при температуре 250 g и четырех градусах Цельсия в течение 10 минут. Ресуспендируйте мышиные АМ в одном миллилитре питательной среды для мыши.

В зависимости от урожайности и экспериментальной необходимости засейте клетки в камерные стекла, чашки для культур или колбы для культур. В идеале засейте AM в дозе 100 000 на миллилитр с 10 миллилитрами среды в колбе для культуры тканей T 25. Инкубируйте клетки в увлажнённом инкубаторе с температурой 37 градусов Цельсия с атмосферой 5% углекислого газа.

Через 24 часа после посева АМ должны быть прилипшими и не будут отделяться при осторожной смене питательной среды. Извлеките среду путем аспирации с одного конца, и пополните свежей средой, предварительно подогретой до 37 градусов Цельсия. Наконец, понаблюдайте за колбой под перевернутым микроскопом.

Показана проточная цитометрическая оценка альвеолярных макрофагов в жидкости бронхоальвеолярного лаважа мышей. Альвеолярные макрофаги являются положительными, идентифицированными как CD45-положительные, CD11c-положительные и Siglec-F-положительные клетки. Здесь показан репрезентативный результат культивирования альвеолярных макрофагов мышей in vitro в течение 24 часов.

Клетки стали адгезивными, и легкая смена питательной среды не приведет к их отделению. После освоения этой техники ее можно выполнить примерно за два часа, если она выполнена правильно. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как отличить альвеолярные макрофаги мыши и человека от других клеток легких.

Также, в качестве процедур получения красивой популяции альвеолярных макрофагов для последующих экспериментов. Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить, что не все резидентные макрофаги или фагоциты легких являются альвеолярными макрофагами. Альвеолярные макрофаги — это тип специализированных клеток, присутствующих в легких с рождения.

Для выделения альвеолярных макрофагов основное внимание следует уделять жизнеспособным методам экстракции из альвеолярного микроокружения. Разработанный здесь метод культивирования in vitro поддерживает рост альвеолярных макрофагов в лабораторных условиях, которые могут быть использованы в молекулярных и клеточных анализах. После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как перенос адоптивных клеток, презентация антигена и оценка реакции на воспалительные стимулы, чтобы ответить на дополнительные вопросы по биологии альвеолярных макрофагов.