Создание трансгенных растений с одной копии вставки с помощью бинарный вектор BIBAC-GW

Общая цель данной методологии заключается в эффективном создании трансгенных растений, несущих неповрежденные, однокопийные вставки транспортной ДНК или Т-ДНК. Вектор BIBAC-Gateway является ценным инструментом для создания трансгенных растений, которые несут неповрежденные, однокопийные вставки последовательностей, представляющих интерес, демонстрирующих стабильную экспрессию генов. С помощью вектора BIBAC-Gateway можно использовать технологию рекомбинации Gateway для вставки интересующих последовательностей с минимальными усилиями.

Все производные BIBAC, включая векторы BIBAC-Gateway, подходят для переноса больших трансгенных фрагментов ДНК в геномы растений. Векторы BIBAC-GW можно использовать для вставки интересующих последовательностей во многие растительные системы, такие как кукуруза, рис и томат. Доступны две плазмиды BIBAC-GW.

Плазмида BIBAC-RFP-GW содержит ген DsRed, который экспрессируется в семенных оболочках. Плазмида BIBAC-BAR-GW содержит ген, обеспечивающий устойчивость к глюфосинату. Оба вектора содержат устойчивый к канамицину ген в качестве маркера селекции у бактерий.

Чтобы вставить интересующие вас последовательности в двоичный вектор, сначала подготовьте вход шлюза и двоичные векторы, как описано в текстовом протоколе. Чтобы провести реакцию Gateway, приготовьте реакцию рекомбинации LR в соответствии с предложениями поставщика в микроцентрифужной пробирке объемом 1,5 миллилитра при комнатной температуре. Смешайте от 100 до 300 нанограмм суперспирального клона Entry и 300 нанограмм вектора BIBAC-Gateway.

Отрегулируйте объем смеси до 16 микролитров с помощью TE. Наконец, добавьте четыре микролитра смеси ферментов LR Clonase и перемешайте путем вортексирования. Выдерживайте смесь при температуре 25 градусов Цельсия в течение одного часа. Завершите реакцию LR, добавив в смесь два микролитра раствора протеиназы К.

Перемешайте и инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия в течение 10 минут, прежде чем приступить к преобразованию в кишечную палочку, как описано в текстовом протоколе. Чтобы подготовить растения Arabidopsis к трансформации, выращивайте растения Arabidopsis в теплице или камере выращивания с контролируемым климатом до тех пор, пока они не начнут цвести. Обрежьте первые болты, чтобы образовалось больше второстепенных болтов.

Растения готовы к погружению через четыре-шесть дней после обрезки, когда у растений много незрелых цветочных головок и мало удобренных силиков. Чтобы выполнить цветочное погружение, окуните соцветия на пять-10 секунд в суспензию агробактерий. Используйте легкое помешивание.

Оберните надземные части растений пищевой пленкой, чтобы поддерживать высокую влажность, и накройте горшки с растениями ящиком, чтобы растения оставались в темноте. Высиживайте растения в течение двух дней в теплице или ростовой камере. Через два дня снимите коробку и пищевую пленку и вырастите растения до зрелости в теплице или камере для выращивания.

Для повышения эффективности трансформации те же растения можно повторно окунать через семь дней после первого погружения. Далее, когда преобразованные растения созреют и высохнут, соберите семена. Объедините и проанализируйте семена растений, преобразованные с помощью той же конструкции, что и один набор.

В случае трансформации растений с помощью производного плазмиды BIBAC-RFP-Gateway, идентифицируйте трансгенные растения путем анализа семян с помощью флуоресцентной микроскопии. Чтобы обнаружить экспрессию DsRed в семенных оболочках, визуализируйте семена с возбуждением 560 нанометров и излучением от 600 до 650 нанометров. Отделите флуоресцентные семена от нефлуоресцентных аналогов с помощью щипцов.

Для скрининга трансгенных растений, трансформированных производным плазмиды BIBAC-BAR-Gateway, высевают семена в лотки, заполненные почвой. Обеспечьте равномерное распределение семян по лоткам, суспензив семена в 0,1%-м агаре в среде 0,5x MS, и распределите семена с помощью пипетки объемом один миллилитр. Стимулируйте прорастание семян синхронным образом, инкубируя семена не менее двух дней при четырех градусах Цельсия.

Это можно сделать до или после посева семян. Через две-три недели после посева семян опрыскайте рассаду 0,5%-ным раствором глюфосината-аммония. Используйте 500 миллилитров глюфосинатно-аммонийного раствора на один квадратный метр.

Пересадите выжившую рассаду в горшки. Проанализируйте устойчивые к глюфосинат-аммонию растения методом ПЦР на наличие интересующего конструкта. Определите количество интеграций Т-ДНК и их целостность с помощью ДНК-блоттинга с использованием ферментов рестрикции.

Этот метод позволяет идентифицировать как одиночные, так и повторяющиеся интеграции в одних и тех же или разных локусах генома. Используйте серию перевариваний ограничений, чтобы определить различные возможные шаблоны интеграции. Выберите фермент, который разрезается один раз в середине Т-ДНК, чтобы иметь возможность независимо зондировать последовательности вверх и вниз по потоку от сайта рестрикции.

Кроме того, выберите фермент или комбинацию ферментов, вырезав сразу всю интересующую вас последовательность. Следите за тем, чтобы использовать только ферменты рестрикции, которые не чувствительны к метилированию цитозина. После проведения ДНК-блоттинга, как подробно описано в текстовом протоколе, проведите блоттинг-анализ.

Анализ зависит от используемой стратегии ограничения. При анализе блоттинга по стратегии с одним сайтом рестрикции в середине Т-ДНК подсчитайте количество обнаруженных фрагментов. В этой стратегии количество гибридизованных фрагментов предполагает количество интеграций Т-ДНК.

Сравните количество обнаруженных фрагментов с помощью зонда для левой и правой стороны Т-ДНК. Если с помощью двух зондов обнаруживается различное количество гибридизующихся фрагментов, то либо присутствуют множественные интеграции Т-ДНК в обратном повторе, либо не полностью интегрированные Т-ДНК. Чтобы идентифицировать тандемное и инвертированное расположение Т-ДНК, оцените размеры гибридизующихся фрагментов на блоттинге на основе размера маркерных полос и сравните оцененные размеры с ожидаемыми размерами фрагментов, рассчитанными на основе стратегии рестрикции.

Чтобы проверить, является ли представляющая интерес трансгенная последовательность интактной, проанализируйте блоттинг, приготовленный в соответствии со стратегией, с сайтами рестрикции на концах интересующей последовательности. Оцените размер гибридизующихся фрагментов на блоттинге на основе размера маркерных полос и сравните его с ожидаемым размером. При неповрежденной вставке получается один фрагмент определенной длины.

Любое отклонение от ожидаемой длины указывает на неполное интегрирование. Показана стратегия рестрикции и блоттинга ДНК для определения количества и интактности интеграций Т-ДНК. Сайт рестрикции ScaI делит репортерную последовательность на левую границу проксимальных частей, которые обнаруживаются при использовании зонда для bar, и правую границу проксимальных частей, которые обнаруживаются при использовании зонда для eYFP.

Сайты рестрикции BglII и PciI расположены внутри Т-ДНК, за пределами репортерной конструкции. Двойное разложение приводит к образованию фрагмента с определенным размером, и любое отклонение является признаком неполного введения. Количество идентифицированных гибридизующихся фрагментов отражает количество вставок Т-ДНК.

Один блот, содержащий геномную ДНК девяти трансгенных веществ, расщепленных с помощью ScaI, был гибридизован с зондами для bar и eYFP. Несколько полос указывают на трансгенные формы с одной интеграцией Т-ДНК. На четвертой полосе отображаются два фрагмента с полосой и один с eYFP, указывающие либо на усечение последовательности eYFP, либо на обратный повтор вокруг правой границы.

На шестой дорожке отображаются два фрагмента с баром и eYFP. Один фрагмент имеет слабую интенсивность с стержневым щупом. Другой фрагмент имеет высокую интенсивность, указывающую на две вставки Т-ДНК, одна из которых усечена.

После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как включить интересующую вас последовательность ДНК в бинарный вектор BIBAC-GW с помощью рекомбинации Gateway с последующим преобразованием Arabidopsis, скринингом и оценкой количества интеграций T-ДНК и их целостности. Создание и определение характеристик трансгенных растений занимает много времени. При использовании BIBAC-Gateway в качестве двоичного вектора процесс идентификации трансгенных объектов с интеграциями с неповрежденными однокопиями может быть сокращен

Около половины трансгенных соединений, полученных с помощью производных BIBAC, содержат неповрежденные интеграции в одной копии. Как правило, люди не осознают, что многие трансгенные растения, созданные с использованием общих бинарных векторов, несут усеченные копии трансгена или трансгенов, которые демонстрируют подавление экспрессии генов. При использовании производных BIBAC большинство полученных трансгенных растений несут неповрежденные, одиночные интеграции трансгена, которые редко демонстрируют сайленсинг генов.

При использовании BIBAC-GW для получения трансгенных веществ важно преобразовать достаточное количество растительных материалов, так как общая эффективность преобразования производных BIBAC ниже, чем у широко используемых бинарных векторов. Эффективность трансформации BIBAC-GW обычно составляет от 0,2% до 0,5%После идентификации трансгенных растений, несущих неповрежденные интеграции Т-ДНК с одной копией, при необходимости, может быть проведен дальнейший анализ для определения точного геномного местоположения вставки Т-ДНК. Трансгенные препараты с интактными интеграциями с одной копией демонстрируют сопоставимые уровни экспрессии трансгенов.

Это указывает на то, что интеграционное положение Т-ДНК в геноме мало влияет на уровень экспрессии трансгена.