Репликация Ordered, неизбыточной библиотека штамма PA14 Transposon вставки мутантов синегнойной палочки

Общая цель этого протокола заключается в создании высококачественных копий упорядоченной, неизбыточной библиотеки транспозонных мутантных данных штамма Pseudomonas aeruginosa PA14, известной как набор PA14NN. Этот протокол сохраняет целостность набора PA14NR во время репликации, генерируя высококачественные копии этой библиотеки. Основное преимущество этого протокола заключается в том, что он предоставляет подробное описание всех этапов, связанных с репликацией библиотеки, контролем качества и правильным хранением отдельных мутантов.

Хотя этот протокол был разработан для репликации набора P14NR, он может быть адаптирован для репликации других бактериальных библиотек. Как правило, люди, плохо знакомые с этим методом, испытывают трудности из-за риска заражения в процессе репликации. Поэтому этот протокол предоставляет подробные пошаговые инструкции по снижению этого риска.

Наша лаборатория распространяет комплект PA14NR для мирового научного сообщества. И мы рекомендуем, чтобы библиотеки тиражировались конечным пользователем. Чтобы предоставить рекомендации, мы предлагаем протокол, в котором подробно описывается, как создавать высококачественные копии библиотеки.

Визуальная демонстрация этого протокола имеет решающее значение, особенно шаги, направленные на предотвращение перекрестного загрязнения. Для самозащиты, а также защиты бактериальных культур при работе с библиотекой мутантных транспозонов штамма P aeruginosa PA14, обозначенной как набор PA14NR, следует всегда надевать лабораторный халат, перчатки и маску. Приготовьте пластины с агаром LB, налив примерно 60 миллилитров расплавленного агара LB в прямоугольные пластины.

Просушите пластины в стерильной вытяжке примерно за час до использования. Создайте стерильное поле с помощью горелки Бунзена на столе, протертом этанолом. И установите контейнеры с соответствующими растворами для стерилизации репликаторных штифтов.

Извлеките подставку PA14NR из морозильной камеры с температурой минус 80 градусов Цельсия и положите ее на сухой лед в кастрюлю для льда объемом 4 литра. Возьмите мастер-пластину 96 лунки, которую нужно воспроизвести из сухого льда, и поместите ее на скамейку, чтобы дать возможность кратковременного оттаивания. Совместите подмастерку и агаровую пластину с координатой А1 обеих пластин в левом верхнем углу.

Отметьте положение координаты А1 на прямоугольной агаровой пластине. Чтобы стерилизовать контакты репликатора, погрузите их в 250 миллилитров от 0,3 до 0,5% гипохлорита натрия на 30 секунд. Слегка постучите по репликатору, чтобы удалить лишнюю жидкость, и погрузите контакты в 250 миллилитров стерильной сверхчистой воды на 10 секунд, затем в 250 миллилитров 70% этанола на 30 секунд и 250 миллилитров 95% этанола на две минуты.

Пламя стерилизует контакты репликатора, держа репликатор перпендикулярно пламени горелки Бунзена, медленно приближаясь к пламени до тех пор, пока этанол не воспламенится, а затем немедленно выводя его из пламени. Пламя погаснет, как только весь этанол сгорит. Охладите штифты, прикрепив их к неиспользованной прямоугольной пластине, содержащей стерильный агар LB, в течение 30 секунд.

Пока штифты репликатора остывают, кратковременно прогрейте рукой алюминиевый уплотнитель с мастер-пластины набора PA14NR, а затем осторожно снимите его, следя за тем, чтобы пломба не ретушировала пластину. Используйте пинцет, чтобы снять остатки алюминиевого уплотнения. Вставьте контакты репликатора в эталонную пластину, осторожно нажимая и раскачивая репликатор во всех четырех направлениях, чтобы убедиться, что контакты контактируют с замороженными бактериальными культурами в каждой из 96 лунок.

Обратите особое внимание на лунки, расположенные на внешнем краю пластины, надавливая штифтами репликатора на замороженные культуры в лунках, расположенных по краю пластины. Аккуратно поместите штифты репликатора на поверхность агаровых пластин. Перемещайте репликатор легкими круговыми движениями, чтобы образовать множество газонов размером примерно от четырех до пяти миллиметров для каждого мутантного штамма.

Запечатайте мастер-пластину комплекта PA14NR новым стерильным алюминиевым уплотнением. Используйте пластинчатый валик, чтобы убедиться, что каждая лунка и края пластины полностью герметизированы. Верните 96 лунку мастерплиты в сухой лед.

После работы с набором PA14NR протрите все рабочие поверхности 70% этанолом. Перенесите растиражированную агаровую пластину в инкубатор с температурой 37 градусов Цельсия и инкубируйте в течение ночи. Перед началом этой процедуры убедитесь, что в колпаке с ламинарным потоком нет ненужного оборудования, и включите вентилятор колпака минимум на 10 минут.

Протрите поверхности вытяжки и любые предметы, помещенные в капот, используя 70% этанол. Используя 12-канальную электронную пипетку объемом от 50 до 1200 микролитров, заполните каждую лунку колодца глубиной 12 миллилитров 525 микролитров жидкого бульона LB, содержащего соответствующие антибиотики. Затем загерметизируйте блок глубокого колодца, прежде чем снимать его с ламинарного колпака.

Затем переложите заполненный средой блок глубокого колодца на столешницу, протертую этанолом. Создайте стерильное поле с горелкой Бунзена на столе и установите контейнеры с соответствующими растворами для стерилизации репликаторными штифтами. Погрузите контакты репликатора в каждое решение, как было показано ранее.

Пламенем простерилизуйте контакты репликатора. Затем охладите кегли, приколов к неиспользованной прямоугольной пластине, содержащей агар LB, в течение 30 секунд. Аккуратно поместите контакты репликатора на агаровую пластину, содержащую выращенные мутантные штаммы, и убедитесь, что они находятся в контакте со всеми 96 мутантами на агаровой пластине.

Затем погрузите штифты в глубокие лунки, содержащие жидкий бульон LB, на пять-10 секунд. Избегайте прикосновения штифтами к стенкам лунок. Загерметизируйте блок глубокого колодца стерильной дышащей уплотнительной мембраной.

Используйте пластинчатый валик, чтобы убедиться, что каждая отдельная лунка правильно герметизирована. Протрите все рабочие поверхности 70%-ным этанолом после работы с комплектом PA14NR. Выращивайте инокулированные жидкие культуры в высокоскоростном встряхивателе при температуре 37 градусов Цельсия и 950 об/мин в течение 15–16 часов.

Начните с очистки колпака с ламинарным потоком и включите вентилятор колпака минимум на 10 минут. Протрите все поверхности вытяжки и любые предметы, помещенные в вытяжку, 70% этанолом. Извлеките пластины 96 лунок из полиэтиленовой пленки.

Снимите этикетку с пластины для каждой пластины и поместите ее вдоль края пластины, ближайшего к лункам от A1 до H1 конечной пластины. Слегка приподнимите крышку таблички назначения и поместите этикетку на нижний край, чтобы она отображалась, когда пластина будет закрыта крышкой. Снимите блок глубокого колодца с высокоскоростного шейкера и перенесите блок в стерильный колпак с ламинарным потоком.

Осторожно снимите дышащую уплотнительную мембрану и замените ее алюминиевым уплотнителем. Раскрутите блок глубоких скважин с очень низкой скоростью, чтобы собрать конденсат. Поскольку перенос культур на конечные планшеты представляет наибольший риск потенциального межскважинного загрязнения, крайне важно тщательно следовать всем процедурам поддержания стерильности.

Верните блок глубокого колодца в стерильный колпак. Используя 12-канальную электронную пипетку объемом от 50 до 1200 микролитров и стерильные фильтрованные наконечники, добавьте 525 микролитров жидкой смеси глицеринового бульона LB в каждую лунку. Перемешайте, аккуратно пипетируя 300 микролитров вверх и вниз три раза с помощью электронной пипетки.

Коснитесь наконечников сбоку от лунок, прежде чем вводить наконечники, чтобы предотвратить капание. Перезагрузите пипетку новыми стерильными отфильтрованными наконечниками, а следующий ряд лунок заполните смесью жидкого бульона с глицерином LB. После того, как все лунки заполнены смесью жидкого бульона LB с глицерином, используйте 12-канальную электронную пипетку и отфильтрованные наконечники, чтобы извлечь 900 микролитров смеси мутантных культур глицерина из каждого ряда блока глубоких лунок и распределить 150 микролитров в лунки соответствующего ряда в целевых планшетах для получения шести копий библиотечной пластины.

Используйте стерильное алюминиевое уплотнение, чтобы покрыть каждую пластину назначения на 96 лунок, и используйте пластинчатый ролик, чтобы полностью герметизировать края пластины и все лунки. Убедитесь, что идентификатор этикетки не закрыт алюминиевой пломбой. Снимите герметичные пластины с вытяжки и поставьте их на ровную ровную поверхность в морозильную камеру при температуре минус 80 градусов по Цельсию.

Протрите все рабочие поверхности 70% этанолом после работы с библиотекой. С использованием протокола, показанного в этом видео, было воспроизведено 12 экземпляров комплекта PA14NR, включая контрольные пластины, которые состоят из модифицированных и немодифицированных скважин типа PA14, интеркалированных по заданной схеме. Контрольные пластины были визуально осмотрены после репликации на пластинах из агара LB, чтобы убедиться в наличии ожидаемых закономерностей роста.

38 мутантных штаммов были случайным образом выбраны из одной из вновь сгенерированных копий набора PA14NR, а для подтверждения идентичности транспозонных мутантов была проведена ПЦР-амплификация с использованием произвольных праймеров. Последующее секвенирование фрагментов ДНК подтвердило мутантную идентичность 35 из 38 протестированных мутантов. После освоения репликация всей библиотеки занимает примерно 80 часов.

При использовании этого протокола важно всегда следить за стерильностью рабочей зоны. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как создавать высококачественные копии набора P14NR или других бактериальных библиотек. Не забывайте, что работа с Pseudomonas может быть опасной, и при выполнении этого протокола всегда следует носить средства индивидуальной защиты.

Этот протокол сохраняет неизбыточную мутантную библиотеку Pseudomonas aeruginosa PA14, которая продолжает оставаться важным ресурсом не только для высокопроизводительного скрининга, но и в качестве источника индивидуальных мутаций в большинстве генов Pseudomonas aeruginosa.