Биолюминесцентных и флуоресцентный ортотопическая сингенных мышиных модель андроген зависимых и кастрация стойкие рака простаты

Цель настоящего Протокола заключается в демонстрации внутри простаты инъекции клеток рака простаты, с последующее кастрация. Ортотопическая доклинических моделей андроген зависимых и кастрация стойкие рака предстательной железы имеют решающее значение для изучения болезни в контексте микроокружения опухоли клинически значимых и иммунокомпетентных хоста.

Общая цель этой процедуры заключается в проведении внутрипростатической инъекции клеток рака мышей для индуцирования образования сингенных ортотопических опухолей, которые могут моделировать как андроген-зависимый, так и кастрационно-резистентный рак предстательной железы. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области рака предстательной железы, например, что стимулирует развитие рака предстательной железы и какие методы лечения лучше всего работают для устранения этих опухолей. Основные преимущества этой методики заключаются в том, что ортотопические опухоли генетически более сложны, они развиваются в клинически репрезентативном опухолевом микроокружении, и их можно генетически модифицировать перед инъекцией.

Применение этого метода распространяется и на терапию рака предстательной железы человека, поскольку ортотопические опухоли реагируют на терапию таким же образом, как это наблюдается у людей. После подтверждения отсутствия реакции на щипывание пальца ноги нанесите мазь на глаза мыши и сбрейте всю шерсть с живота животного. Простерилизуйте открытые участки кожи с помощью трех раундов хирургического скраба с использованием стерильных неадгезивных салфеток, за которыми следуют стерильные спиртовые салфетки.

Когда кожа высохнет, положите мышь в лежачем положении на чистую поверхность над грелкой прямо под объектив чистого хирургического микроскопа. И накройте животное стерильной простыней с небольшим отверстием, вырезанным над животом. Сделайте разрез в один сантиметр на наружной коже и внутренней мускулатуре живота по средней линии живота, выше полового члена и препуциальных желез.

Найдите один из двусторонних семенных пузырьков и прикрепленных к ним долей передней предстательной железы, которые обычно находятся сзади, латеральнее и немного выше мочевого пузыря Попросите ассистента смешать раствор раковых клеток MIC-CAP Matrigel с щадящим пипетированием и медленно аспирировать 30 микролитров клеток в иглу 28 калибра, прикрепленную к шприцу объемом 50 микролитров. Затем, используя щипцы для тканей Graefe, осторожно поднимите кончик одного семенного пузырька, чтобы создать натяжение ткани без прокола пузырька, и осторожно введите скос иглы параллельно длинной оси передней доли предстательной железы. Медленно вводите весь объем клеток в долю с последующим медленным втягиванием иглы для предотвращения утечки.

Успешная инъекция будет проявляться по набуханию передней доли предстательной железы. Осторожно и неуклонно поддерживайте семенной пузырь и введенную долю предстательной железы за пределами мыши в течение примерно 30 секунд, чтобы позволить матригелю частично затвердеть в доле. Используйте стерильный аппликатор с полиэфирным наконечником для сбора любого клеточного раствора, протекающего в брюшную полость, чтобы предотвратить развитие неортотопических опухолей.

Точная интрапротезная инъекция имеет решающее значение для развития неортотопических опухолей. Если вы будете проявлять особую осторожность, чтобы избежать прокола семенного пузырька, медленно вводить суспензию раковых клеток и собирать любые утечки клеток, это повысит успех этой процедуры. Теперь аккуратно верните семенной пузырь и введенную долю в брюшную полость, не оказывая давления на мочку, и замените любые внешние ткани.

Используя рассасывающиеся игольчатые швы обратного разрезания 5-0 викрила, закройте внутреннюю мускулатуру брюшной полости непрерывными швами с последующим закрытием наружной кожи живота прерывистыми швами с использованием нейлоновых монофиламентных нерассасывающихся швов иглой обратного разрезания 4-0. Затем проводят послеоперационное обезболивание и помещают мышь в клетку без подстилки наполовину на грелку с контролем до полного выздоровления. Стабильная трансфекция клеток Myc-CaP для получения люциферазы светлячков и экспрессии mCherry позволяет проводить неинвазивные биолюминесценции и флуоресценции in vivo.

Здесь показаны репрезентативные опухоли, рассеченные из брюшной полости на 30-й день после интрапростатической инъекции. При правильной технике объем и вес опухоли могут быть зарегистрированы с относительно небольшой стандартной погрешностью, хотя ожидается некоторая вариабельность между малыми и большими опухолевыми массами. Интрапростатально введенные раковые клетки мышей также могут быть проанализированы с помощью иммуногистохимии на наличие инфильтрирующих опухоль CD3-положительных Т-клеток или других представляющих интерес иммунных клеток.

Более того, эта модель обеспечивает объективную конечную точку выживаемости, поскольку большая первичная опухолевая масса вызывает геморрагический абдоминальный асцит и/или снижение ухода за собой при передвижении и/или пилоэрекции. Кастрация через три дня после интрапростатической инъекции приводит к устойчивой регрессии опухоли с последующим возможным рецидивом опухоли примерно через 30 дней, что является репрезентативным для кастрационно-резистентного рака предстательной железы. Вскрытие и гистологический анализ кастрационно-резистентных опухолей рака предстательной железы не выявляют нейроэндокринной дифференцировки, поскольку опухоли поддерживают высокий уровень андрогенных рецепторов и являются отрицательными по нейроэндокринному маркеру синаптофизину.

После освоения этой техники она может быть выполнена за 20-30 минут при правильном выполнении. Пытаясь провести эту процедуру, важно помнить о введении предоперационных и послеоперационных анальгетиков и выполнять все операции с использованием стерильной техники и с помощью хирургического ассистента. После этой процедуры могут быть использованы другие методы, такие как иммуногистохимия, проточная цитометрия и оценка объема и веса опухоли, а также выживаемости животных, чтобы ответить на дополнительные вопросы об ответе на иммунотерапию и другие экспериментальные методы лечения.

После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как вводить клетки рака предстательной железы в переднюю долю предстательной железы мышей для возможной хирургической кастрации и анализа регрессии опухоли и рецидива. Не забывайте, что работа с раковыми клетками может быть чрезвычайно опасной, и существуют меры предосторожности, такие как ношение правильных средств индивидуальной защиты, которые всегда должны быть приняты во время выполнения этой процедуры.