Метод для высокой скорости стретч травмы человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток нейронов в формате 96-луночных

Общая цель этой модели заключается в создании клинически значимого фенотипа нейротравмы в формате 96 лунок, чтобы облегчить эффективное и одновременное сравнение травмы, полученной в нескольких экспериментальных условиях. Основная цель этой модели заключается в том, чтобы обеспечить проведение скрининга фенотипических открытий с высоким содержанием лекарств при нейротравме с помощью индуцированных человеком нейронов, полученных из плюрипотентных стволовых клеток. Пластины, используемые в этой модели, сохраняют стандартную для отрасли геометрию 96-луночных планшетов, сохраняя их совместимость с существующим оборудованием для скрининга с высоким содержанием содержимого, таким как роботизированные руки и автоматизированные микроскопы.

Для начала поместите бездонную 96-луночную пластину нижней стороной вверх внутрь плазменного очистителя мощностью 200 Вт на 60 секунд на высокой мощности. Далее поместите тарелку в 200 миллилитров свежеприготовленного 1,5%-ного APTES в деионизированную воду нижней стороной вниз на 20 минут в вытяжной шкаф. Через 10 минут после начала инкубации с помощью щипцов расположите обработанную плазмой силиконовую мембрану поверх прямоугольника из пергаментной бумаги размером 7,5 на 11 см и выровняйте алюминиевую плиту размером 7,5 на 11,05 см в нижней части зажима для изготовления пластин.

Затем с помощью щипцов выровняйте силиконовую мембрану и пергаментную бумагу по алюминиевой плите. По окончании периода нанесения покрытия извлеките бездонную пластину из ванны APTES и стряхните излишки раствора. Опустите бездонную пластину в две последовательные 200-миллилитровые ванны с деионизированной водой на пять секунд каждое погружение и стряхните лишнюю воду.

После полного высыхания сжатым воздухом поместите бездонную пластину в верхнюю часть зажима для изготовления пластин и осторожно закройте зажим, чтобы прижать бездонную пластину и силикон вместе. Чтобы выровнять блок индентора, с помощью зажимов столика закрепите пластину на столе устройства для натяжения под камерой с прямой трансляцией, а над устройством разместите купольный светильник. Запустите программное обеспечение для управления прибором на компьютере, подключенном к устройству для травмы, и нажмите на окно «Запуск», чтобы запустить проект нейротравмы in vitro.

В окне проекта дважды кликните по виртуальным инструментам «Управление движением» и «Трекер положения». Закройте клетку, окружающую устройство для травмы, и нажмите на стрелку в виртуальном инструменте управления движением, чтобы запустить инструмент. Щелкните в нижней части, чтобы опустить столик на расстояние двух миллиметров от контакта с инденторами, затем нажмите кнопку «стоп», чтобы остановить виртуальный прибор.

В окне проекта щелкните правой кнопкой мыши по Axis One и выберите Interactive Test Panel. Введите 500 единиц в поле «Целевая позиция» в появившемся окне, чтобы установить размер шага 50 микрометров. Затем нажимайте кнопку Go несколько раз, пока пластина не соприкоснется с любыми отступами, проверяя наличие контакта на живом изображении, отображаемом камерой.

Вертикальное положение рабочей области будет отображаться в верхнем левом углу окна интерактивной тестовой панели. Опускайте пластину дальше, пока каждая лунка не соприкоснется с инденторами, перемещая камеру и столик по мере необходимости, чтобы увидеть всю пластину. Обратите внимание на указанное вертикальное положение рабочей области, когда все посты находятся в контакте, и закройте интерактивную тестовую панель.

Затем запустите виртуальный инструмент управления движением и нажмите «Вверху», чтобы поднять сцену, используя кнопку «стоп», чтобы остановить виртуальный инструмент, когда сцена находится на месте. Откройте дверцу, чтобы деактивировать устройство, затем ослабьте винт сета на углу, который соприкоснулся первым, чтобы опустить угол, и затяните противоположный винт, чтобы поднять угол, который соприкасался последним. Повторяйте опускание, наблюдение и регулировку блока до тех пор, пока пластина не соприкоснется со всеми инденторами одновременно.

Тщательное выравнивание блока инденторов важно для достижения равномерного повреждения во всех лунках пластины. Откройте дверцу, чтобы снова деактивировать устройство, и вставьте крепежные винты в свои отверстия на блоке инденторов. Затем затяните винты в нужном положении и запишите положение предметного столика, которое сообщает интерактивная тестовая панель при контакте пластины.

Чтобы растянуть пластину, измените имя файла в поле «Путь к файлу» в виртуальном инструменте для проверки положения на уникальное имя файла и нажмите стрелку «Выполнить». Задайте глубину и продолжительность отступа, а также поля «Травма» и «Продолжительность травмы» в виртуальном приборе панели управления движением. Когда пластина находится в нулевом положении, запустите виртуальный прибор на панели управления движением и нажмите «Травмировать», чтобы сделать отступ на пластине.

Нажмите «Сверху», чтобы переместить ступень вверх, нажмите «Стоп», когда пластина окажется в верхнем положении, и откройте дверцу, чтобы отключить устройство для травмирования. Затем изучите историю перемещений ступени, представленную в виртуальном приборе трекера положения, чтобы подтвердить, что было применено указанное максимальное перемещение, и экспортируйте данные в соответствующую программу для работы с электронными таблицами. Чтобы оценить растяжение силиконовой мембраны, после плазменной обработки поместите пластину на мягкую поверхность, а небольшой выступ на штампе загрунтуйте чернилами от перманентного маркера.

Вставьте штамп в первую проверяемую лунку и постукивайте, чтобы убедиться в хорошем переносе чернил. После того, как все скважины будут проштампованы, поместите высокоскоростную камеру на стойку стрелы над устройством травмирования с объективом, установленным на наименьшую пронумерованную F-ступень так, чтобы в поле зрения было 12 инденторов в сетке три на четыре. Когда место находится в положении нулевой точки, необходимо нажать кнопку записи в программном обеспечении камеры, чтобы она считывала спусковой крючок, и включить яркий рассеянный осевой свет.

Затем сделайте отступ на пластине, как показано только что на рисунке, и выключите осевой свет. Чтобы повредить клеточную культуру, добавьте 100 микролитров обработанных ламинином индуцированных человеком нейронов, полученных из плюрипотентных стволовых клеток, в каждую лунку обработанной плазмой планшета и дайте клеткам прикрепиться к дну планшета в течение 15 минут при комнатной температуре, прежде чем поместить планшет в инкубатор для клеточных культур. После двух-трех дней культивирования зажмите пластину на ступице устройства для травмирования и отрегулируйте положение крышки, чтобы зафиксировать пластину, не подвергая культуры воздействию окружающего воздуха.

Затем, когда пластина находится в положении нулевой точки, сделайте отступ на пластине, как показано на рисунке. Оптимальная неповрежденная культура должна иметь мало скоплений, состоящих более чем из пяти клеток, а нейриты будут индивидуальными, длинными, тонкими и изогнутыми, с небольшим количеством бусин или без них. В идеальных условиях жизнеспособность культур должна вплотную приблизиться к жизнеспособности, указанной в паспорте производителя, а культуры на силиконе должны напоминать культуры, сохраняющиеся на обычных жестких культуральных субстратах.

Увеличение плотности клеток увеличивает количество и размер комков, образующихся в культуре, в то время как увеличение концентрации ламинина обычно противодействует этому эффекту. В культурах, поврежденных с пиковой деформацией 57%, через четыре часа после повреждения нейриты укорачиваются или отсутствуют, а в некоторых из них гранулы слипаются со сликованием, демонстрируемым оставшимися жизнеспособными клетками. Примечательно, что лечение более высокими дозами ламинина снижает тяжесть повреждения клеточных культур в зависимости от концентрации, о чем свидетельствует увеличение длины нейритов и жизнеспособности клеток в культурах, обработанных более высокими дозами ламинина.

При попытке выполнить эту процедуру важно учитывать время выполнения заказа. Например, мембранная детоксикация занимает три дня, а изготовленные пластины перед использованием должны затвердеть за ночь. Не забывайте, что устройство для защиты травм содержит мощную звуковую катушку для управления его движением, и всегда следует держаться подальше от устройства, когда оно активно, и выключать устройство только тогда, когда сцена находится на вершине своего движения.