Протокол для острой и хронической экотоксичности тестирования бирюза Пецилиевые рыбы Nothobranchius furzeri

Общая цель этого эксперимента — изучить воздействие токсикантов на бирюзового киллифиша Nothobranchius furzeri. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области экотоксикологии, такие как долгосрочное воздействие стрессоров на важные черты жизненного цикла, такие как время созревания, роста или плодовитости. Основное преимущество этого эксперимента заключается в том, что мы используем позвоночное животное с очень быстрым жизненным циклом, что приводит к эффективным экспериментам по времени и затратам.

Эти рыбы-убийцы являются идеальными моделями для изучения влияния долгосрочных и многопоколенческих эффектов стрессоров. В конечном счете, они будут способствовать лучшему пониманию воздействия токсикантов на окружающую среду. Хотя этот метод может дать новое представление о комбинированном воздействии токсикантов и температуры, он также может быть применен к другим стрессовым факторам, таким как ультрафиолетовое излучение, лишение пищи и изменения PH.

С рыбами-убийцами сложно работать, потому что это новая модельная система в экотоксикологии, а их чувствительность ко многим загрязнителям до сих пор неизвестна. Идея этого экспериментального метода пришла нам в голову, когда мы впервые узнали об исключительной короткой продолжительности жизни рыб-убийц и их способности производить спящую икру, которая может храниться годами на полке. Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, так как тип эксперимента, а также обращение с индивидуумами могут изменить результаты.

Для начала выберите зоопарк гона-скатов, или яйца GRZ, находящиеся на стадии D3, которые узнаваемы по наличию золотистых глаз. И с помощью мягкого пинцета аккуратно переложите их в пластиковый двухлитровый бак. Добавьте один сантиметр инкубационной среды при температуре 12 градусов по Цельсию и дайте воде постепенно довести температуру до комнатной.

Через 24 часа накормите вылупившихся мальков концентрированной дозой только что вылупившихся науплий артемий и увеличьте глубину воды до пяти сантиметров, добавив рыбную среду. Через 48 часов после вылупления перенесите здоровых, плавучих личинок в отдельные контейнеры с экспозицией и концентрацией токсикантов, как описано в текстовом протоколе. Каждое утро и вечер проверяйте рыбу на смертность, стресс и болезни, а также рассчитывайте значения LC50 в соответствии с текстовым протоколом.

Проведите испытание хронического воздействия, заполнив отдельные контейнеры подходящей средой для воздействия, и добавьте воздушную трубку для проветривания банки. Переложите рыбу в банки до конца эксперимента. С двух по 23 день после вылупления или ДФН кормите рыб науплиями артемий два раза в день в неограниченном количестве.

Затем, после добавления измельченных личинок хирономуса до 37 DPH, используйте замороженных личинок хирономуса для кормления рыб в неограниченном количестве два раза в день, каждый день, продвигаясь вперед. Чтобы определить рост, измеряйте размер тела еженедельно, перекладывая рыбу в чашку Петри, наполненную средой из водоема. Сделайте четыре-пять откалиброванных по размеру снимков спинного вида рыб на фиксированной высоте.

И используйте программу пространственных измерений для их цифрового анализа. Начиная с 15 DPH и далее, визуально осматривайте самцов рыб на предмет окраски, чтобы определить степень созревания. Проверьте плавники на наличие первых признаков брачной окраски и используйте день, когда окраска кулака была видна, в качестве показателя времени созревания самцов.

Начиная с 30 DPH и далее, проверяйте плодовитость, устанавливая литровый нерестовый аквариум для половозрелых самцов и самки в рамках каждой обработки, используя среду воздействия из аквариума самца, и дополняя его нерестовым субстратом. Пересадите в нерестовик как самца, так и самку. И при этом свести к минимуму человеческую активность или беспокойство вокруг нерестовых контейнеров, позволить им нереститься в течение двух часов.

После этого, без лишнего перемешивания воды, которая будет закручивать икру в нерестовом субстрате, аккуратно пересадите рыб обратно в их первоначальные емкости для содержания. Отфильтруйте икру, насыпав нерестовый субстрат на ячейку размером 500 микрометров. Пересчитайте яйца и с помощью пипетки переложите их во влажный торфяной мох в чашки Петри.

Удаляйте мертвые яйца ежедневно. Через неделю используйте герметизирующую пленку, чтобы запечатать чашку Петри. И храните его в инкубаторе с регулируемой температурой при температуре 28 градусов Цельсия с циклом от 14 до 10 от света к темноте, для немедленного развития до фазы D3.

Для долгосрочного хранения храните яйца в постоянной темноте при температуре 17 градусов по Цельсию, после чего яйца вступают в фазу покоя и остаются жизнеспособными в течение нескольких лет. Чтобы набрать рыбу из спящей икры, перенесите икру при температуре 28 градусов по Цельсию и цикле от 14 до 10 от светлого к темному, примерно на три недели, чтобы позволить ей развиться до фазы D3. Чтобы измерить критический тепловой максимум, или CT max для взрослых рыб, начните с непрерывно циркулирующей водяной бани, нагреваемой с постоянной скоростью 0,33 градуса Цельсия в минуту.

Добавьте несколько литровых аквариумов, для каждой отдельной рыбки. Начните тропу с добавления рыб в аквариум, когда вода достигнет экспериментальной температуры выращивания рыб. Используйте цифровой термометр для контроля температуры в литровых аквариумах ванны CT max каждые пять минут.

Когда рыба не может удерживать спинную брюшную вертикаль или начинает сильно дергаться, измерьте температуру в литровом аквариуме, которая является критической максимальной температурой. Затем перенесите рыбу обратно в экспериментальное жилье для восстановления. Как показано на этом графике, острое воздействие энфурцеров на различные концентрации меди, вызывало увеличение смертности с увеличением концентрации токсиканта.

Значения LC50 со временем уменьшаются, а это означает, что с уменьшением концентраций проходит больше времени, прежде чем 50% репликантов погибают. В анализе на хроническое воздействие с использованием меди, рожденной в воде, рыба становится короче по длине, что измеряется через три недели при выращивании в самой высокой концентрации. В этом эксперименте с использованием хлорпирифоса на водной основе или CPH при нагревании до 28 градусов Цельсия рыба производила меньше икринок при воздействии самой высокой концентрации CPF, однако при 30 градусах Цельсия контрольная рыба производила больше икринок, чем рыба, подвергшаяся воздействию любой концентрации CPF, что указывает на то, что сочетание CPF и повышения температуры влияет на плодовитость больше, чем каждый стрессор в отдельности.

Здесь указан средний возраст, в котором появились первые признаки окраски у самцов энфурзери, подвергшихся воздействию ЦПФ при температуре 28 и 30 градусов Цельсия. После воздействия четырех микрограммов на литр CPF самцам рыб потребовалось на 18% больше времени, чтобы созреть, чем контрольным рыбам. Измерение CT max у рыб, выращенных при температуре 24 или 28 градусов по Цельсию, и воздействие загрязнителя 3, 4-DCA показало, что беспорядочное плавание, повышенное оперкулярное движение и потеря способности оставаться в дорсовентральном вертикальном положении происходили при более низкой температуре, когда рыбы выращивались при температуре 24 градуса Цельсия.

После освоения этого протокола, включая влияние на плодовитость, можно измерить за два месяца. Чтобы измерить влияние на весь репродуктивный период или даже на последующее поколение, протокол может быть расширен, но все еще может быть выполнен через шесть месяцев.