ТРИФОСФАТЫ опосредованной потери функции анализа в мозжечковой грануле клеток с помощью в утробе матери на основе электропорации перенос генов

Общая цель этого подхода к переносу генов in vivo, основанного на электропорации, заключается в оценке роли генов, представляющих интерес, в дифференцировке гранулярных клеток мозжечка с использованием CRISPR-опосредованного анализа потери функции. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в нейронауках развития и нейроонкологии, такие как идентификация молекул, важных для нормального развития мозжечка и образования опухолей головного мозга. Процедуру внутриутробной электропорации продемонстрирует доктор Лена Хербст, постдок из лаборатории профессора Петера Лихтера, а затем следующая иммуногистохимия будет выполнена доктором Вэйцзюнь Фэном, постдоком из лаборатории доктора Хайкун Ди.

Основное преимущество этого метода заключается в том, что с помощью технологий CRISPR-cas9 можно попытаться практически нокаутировать гены, представляющие интерес в клетках мозжечка, вместо генерации комбинации нокаутированных животных. Хотя этот метод может дать представление о функциях генов во время нормального развития мозжечка, он также может быть применен к другим системам, таким как развитие других физических областей мозга и моделирование опухолей мозга. Начните с загрузки капилляра из боросиликатного стекла в пуллер для микропипеток и потяните, чтобы получить тонкий наконечник.

Пометьте кончик капилляра черными чернилами для лучшей визуализации во время инъекции, а на стекле нарисуйте шкалу. Работая под стереомикроскопом, используйте линейку и острый игольчатый пинцет, чтобы обрезать кончик до длины около шести миллиметров и создать острый, односторонний скошенный край. Отфильтруйте 1%-ный быстрый раствор зеленого материала через фильтр нулевой точки 22 микрона, чтобы удалить частицы красителя из раствора.

Смешайте однонаправляющие РНК-плазмиды в равных частях с репортерной плазмидой люциферазы до конечной концентрации не менее одного микрограмма на миллилитр для каждой плазмиды. Окрасьте плазмидный раствор быстрым зеленым цветом с конечной концентрацией 0,5%После обезболивания беременной мыши CD-1 изофлураном положите мышь на спину на грелку и введите обезболивающее. Наносите глазную мазь, чтобы предотвратить сухость глаз во время операции.

Зафиксируйте линзу скотчем и простерилизуйте брюшную полость дезинфицирующим средством. Накройте мышь марлей, оставив открытой только операционную область. После того, как вы сделаете разрез кожи длиной около двух сантиметров, найдите белую линию и с помощью ножниц с тупым концом ткани сделайте второй разрез немного меньшего размера через брюшину.

Смочите вскрытую брюшную полость предварительно подогретым стерильным ПБС. Далее с помощью кольцевых щипцов аккуратно извлекают рога матки из брюшной полости. Возьмитесь за стенку матки в промежутке между желточными мешочками двух соседних эмбрионов и слегка потяните.

Избегайте любого давления на эмбрион во время протягивания его через разрез. После извлечения рогов матки аспирируйте примерно от 10 до 15 микролитров цветного раствора плазмиды с подготовленным стеклянным капилляром. Избегайте попадания пузырьков воздуха во время этого процесса.

Аккуратно удерживайте эмбрион кольцевыми щипцами и найдите область шеи. Медленно проникайте в дорсальный задний мозг кончиком стеклянного капилляра и продвигайтесь в четвертый желудочек. Введите около одного микролитра плазмидной смеси.

Подтвердите, что окрашенная ДНК не утекла из мозга, а видна в виде ромбовидной структуры. Здесь наиболее важно заполнить всю область четвертого желудочка раствором плазмиды, доставить ДНК также в дистальную часть зачатка мозжечка. В то же время убедитесь, что во время этого процесса не возникает кровотечения.

Поместите платиновый пинцет, оснащенный электродными пластинами диаметром пять миллиметров, боково над головой эмбриона, причем отрицательный полюс закрывает ухо, а положительный полюс расположен в мозжечковом зачатке над стенкой матки, и подайте электрические квадратные импульсы. Когда все эмбрионы будут подвергнуты электропоре, осторожно поместите рога матки обратно в брюшную полость, и заполните их стерильным PBS. Дайте рогам матки сместиться в естественное положение.

Выключите анестезию и поместите животное животом вниз в новую клетку для восстановления. Перед криосекцией зафиксируйте мозжечок на ночь в пяти миллилитрах 4% PFA в PBS на мозг, при четырех градусах Цельсия. На следующий день перенесите неподвижный мозжечок в десять миллилитров 30% сахарозы в PBS на мозг и инкубируйте в течение ночи при четырех градусах Цельсия.

На следующий день, после того как ткань опустится на дно трубки, удалите мозги из сахарозы и впитайте оставшийся раствор сахарозы куском целлюлозной фильтровальной бумаги. Далее погрузите каждый мозжечок в состав оптимальной температуры резки в одноразовую пластиковую форму, и заморозьте на сухом льду. Разрежьте криогенный блок на секции толщиной 10 микрон с помощью криостата и держите секции при температуре минус 80 градусов Цельсия до использования.

Когда будете готовы приступить к иммуноокрашиванию, сначала высушите предметные стекла при комнатной температуре в течение 30 минут, а затем дважды постирайте по 10 минут каждый раз в PBS. Обведите срезы жидкостной блокирующей ручкой и инкубируйте срезы в блокирующем растворе в течение часа при комнатной температуре. Добавьте первичные антитела против молекул, представляющих интерес в блокирующем растворе, и инкубируйте в течение ночи при четырех градусах Цельсия.

Промойте предметные стекла 0,1% Тритоном, содержащим PBS, три раза по 10 минут каждый. Затем добавьте флуорофорное конъюгированное вторичное антитело, разведенное в блокирующем растворе, содержащем DAPI, и инкубируйте срезы в течение одного часа при комнатной температуре в темноте. Промойте предметные стекла в PBS-T три раза в течение 10 минут каждый раз, затем установите предметные стекла и держите при температуре четыре градуса Цельсия до получения изображения.

Клетки hek293T, стабильно экспрессирующие Streptococcus pyogenes cas9, трансфицировали плазмидами, экспрессирующими sgRNA и нацеленными на них. Экспрессию GFP в живых клетках контролировали с помощью флуоресцентного клеточного тепловизора через 48 часов после трансфекции. На этом изображении показана пораженная последовательность sgРНК на основе экспрессии GFP.

На этом изображении показано отсутствие экспрессии GFP в результате неэффективной последовательности sgРНК. На этих изображениях показано иммуноокрашивание GFP, Ki67 и p27 в мозжечке у мыши p7-rosa26-LSL-cas9 с флоксированной стоп-кассетой и последовательностями bicistronic cas9 и EGFP, которые были подвергнуты электропорации в E13.5 с плазмидой Cre, экспрессирующей контрольную sgRNA. Секция имеет противодействие DAPI.

Обратите внимание на GFP-экспрессирующие клетки во внешнем слое гранулярных клеток, отмеченные Ki67. После освоения эта операция может быть выполнена менее чем за 30 минут на одной мыши. При проведении этой процедуры важно помнить о том, что с эмбрионом нужно обращаться очень осторожно, всегда использовать капилляры с острыми концами и располагать электроды под точным углом, чтобы обеспечить доставку электрических импульсов к крыше четвертого желудочка.

После своего развития этот метод проложил путь исследователям в области медицинских наук к изучению причинных факторов неврологических расстройств, в том числе опухолей головного мозга в мозжечке мыши.