Гель seq: Метод для подготовки библиотека одновременных секвенирования ДНК и РНК с помощью матрицы Гидрогель

Общая цель этого эксперимента состоит в том, чтобы создать библиотеки секвенирования нового поколения как из ДНК, так и из РНК небольших популяций клеток без разделения образца в какой-либо точке. Этот метод предоставляет исследователям новый подход к изучению структурных вариаций ДНК по экспрессии генов. Когда мы впервые придумали Gel-seq, не существовало протоколов для одновременного секвенирования ДНК и РНК из одного и того же образца.

К счастью, в настоящее время существует три опубликованных подхода, которые решают эту проблему. Основное преимущество этого метода заключается в том, что как геномная, так и транскриптомная информация могут быть получены из одного и того же набора клеток с незначительными дополнительными затратами. Gel-seq изначально разрабатывался с вертикальными кассетами, однако этот протокол может быть адаптирован для работы с любой стандартной кассетой для гелевого электрофореза.

Приготовьте наполнитель, смеси прекурсоров высокой плотности и низкой плотности в трех пробирках. Добавьте реагенты в описанном порядке, и сделайте смесь вихревой. Не стоит преждевременно добавлять ни APS, ни Temed.

Подождите, пока не поступит указание. Далее дегазируйте каждый раствор гелевого мономера, сначала вставив иглу через колпачок. Затем подключаем иглу к домашней вакуумной линии, и погружаем эту сборку в ультразвуковую ванну.

Подождите около минуты, пока из жидкости больше не появятся пузырьки. Далее в смесь наполнителя добавьте Темед и АФС и кратко перемешайте. В течение трех минут с помощью одномиллиметровой пипетки добавьте шесть миллиметров в каждую гелевую кассету, не проливая.

Убедитесь, что жидкость ровная, расположив кассеты вертикально на горизонтальном столе. Затем постепенно доливайте в кассеты дегазированную, ионизированную воду, стараясь свести к минимуму смешивание полимеризующейся смеси с водой. Затем дайте полимеру затвердеть в течение часа или на ночь.

Как только полимер затвердеет, слейте слой воды и с расстояния шести дюймов используйте мягкую струю сжатого воздуха, чтобы высушить поверхность геля. Далее добавьте Темед и APS в прекурсор геля высокой плотности, и кратковременно сделайте вортекс. В течение трех минут перелейте по 320 микролитров в каждую кассету и распределите его по слою наполнителя, покачивая кассету вперед и назад несколько раз.

Затем долейте до кассет деионизированную, дегазированную воду и дайте полимеру затвердеть в течение часа. После отверждения высушите полимер, как и раньше. Наконец, добавьте Темед и APS в смесь гелевого предшественника низкой плотности и сделайте ее вихревой.

Затем быстро заполните оставшуюся часть кассет этой смесью и вставьте гелевые расчески до того, как она начнет затвердевать. Теперь добавьте избыток резервного прекурсора на гребень, который будет адсорбирован во время полимеризации. После отверждения кассета готова к использованию.

После преобразования РНК в кДНК используйте гель для восстановления интересующей вас фракции. Сначала тщательно очистите камеру электрофореза с помощью нескольких миллилитров средства для удаления ДНК и безворсовой салфетки. Затем заполните камеру чистым XTBE с нулем целых пять десятых и поместите весь аппарат в 254-нанометровую печь для сшивания УФ-излучением и стерилизуйте в течение 15 минут.

Теперь вставьте кассету Gel-seq в камеру электрофореза и зафиксируйте ее на месте. Затем медленно снимите гелевую расческу, осторожно потянув вверх, не разрывая гель. Теперь загрузите образцы с помощью пипетки.

Полностью вставляйте наконечник в лунки при загрузке образцов, чтобы свести к минимуму вероятность загрязнения между лунками. Подайте электрическое поле напряжением 250 вольт на кассету Gel-seq в течение 30 минут, чтобы отделить гДНК от гибридов кДНК/РНК. После загрузки, запуска и сбора геля используйте скальпель, чтобы разрезать гель пополам чуть ниже слоя высокой плотности, и выбросьте половину геля-наполнителя.

Затем аккуратно снимите остатки геля с кассеты, осторожно используя скребковый инструмент. После проверки отделения с помощью гелевого doc используйте трансиллюминатор для иссечения лент. ГДНК должна быть расположена в начале геля низкой плотности, а кДНК должна находиться на границе областей низкой и высокой плотности.

Теперь с помощью скальпеля вырежьте участки геля, содержащие гДНК и кДНК. Также удалите эти же участки с полосы отрицательного контроля. С помощью притупленного пинцета аккуратно переложите срезы геля в полосковые пробирки.

Если гель сломался, найдите и перенесите все сломанные кусочки в тюбик. Далее измельчите каждый гель круговыми движениями, и надавливайте наконечником пипетки. Перед удалением кончиков добавьте 40 микролитров воды, не содержащей нуклеаз, в гДНК и 80 микролитров в образцы кДНК.

Затем аккуратно снимите и выбросьте кончики. Теперь закрепите полосковые трубки на вихревом миксере при температуре 37 градусов Цельсия и встряхивайте их в течение восьми-12 часов. Таким образом, ДНК будет ускользать от геля.

После встряхивания поместите образцы пипеткой в фильтрующую пластину с ячейкой восемь микрон. Затем вращайте пластину при температуре 2 600 г в течение пяти минут, чтобы процедить фрагменты геля. Затем поднимите сетчатую фильтрующую пластину в сторону от корпусной пластины и с помощью пипетки перенесите образцы без геля с планшета в новые пробирки объемом 200 микролитров

К каждому образцу, содержащему гДНК, добавьте один микролитр протеазы и пипеткой вверх и вниз, чтобы хорошо перемешать. Затем инкубируйте образцы при температуре 50 градусов Цельсия в течение 15 минут. Затем активируйте подогрев при температуре 70 градусов Цельсия в течение 15 минут.

Этот этап истощения нуклеосом имеет решающее значение. Затем с помощью иглы 18 калибра проделайте отверстие в крышке каждой пробирки с образцами. Затем с помощью вакуума уменьшите количество образцов гДНК до пяти микролитров, а образцов кДНК — до 10 микролитров.

Если объем падает ниже целевого значения, при необходимости добавляйте воду, не содержащую нуклеаз. Гибриды гДНК и кДНК/РНК были физически разделены с помощью устройства Gel-seq. Отрицательный регулятор не имеет автоматической флуоресценции геля на границах раздела.

Лестницы ДНК показывают только темную полосу на границе между мембранами низкой и высокой плотности, показывая, что небольшие фрагменты могут проходить через гель низкой плотности. Биологический образец из 500 клеток PC3 показывает желаемое разделение геномной ДНК и гибридов кДНК/РНК. Темная полоса в верхней части мембраны низкой плотности представляет собой геномную ДНК мегабазового масштаба, в то время как гибриды кДНК/РНК уложены на границе областей низкой и высокой плотности.

Небольшие фрагменты пар оснований ниже 100 являются нецелевыми продуктами, образующимися из олигонуклеотидов праймеров во время обратной транскрипции, и их следует ожидать. Библиотеки были сгенерированы из 500 клеток PC3 или 750 клеток HeLa. Распределения фрагментов из совпадающих библиотек, сгенерированных с помощью Gel-seq, сравнивались с несовпадающими сэмплами, сгенерированными с помощью стандартных протоколов.

Распределение фрагментов нуклеотидов было сходным при использовании обоих методов. Результаты секвенирования библиотеки клеток PC3 сравнивались с традиционными методами. Сравнивались вариации числа копий по всему геному.

Статистически эти два метода получили схожие результаты. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как создать парные библиотеки секвенирования нового поколения для ДНК и РНК из одного и того же исходного образца. Как и в любом эксперименте с секвенированием с низкими затратами, крайне важно помнить о поддержании чистоты на рабочем месте.

Следует уделить особое внимание стерилизационным трубкам и перчаткам для очистки. Даже при соблюдении этих мер предосторожности эксперименты иногда терпят неудачу из-за загрязнения. Важное замечание, повсеместное распространение и безопасность полиакриламидных гелей позволяет легко забыть о том, что предшественниками изготовления являются опасные нейротоксины.

Вы всегда должны работать с этими реагентами в вытяжном шкафу и немедленно убирать любые разливы. Мы разработали Gel-seq так, чтобы исследователям было легко внедрить его в своих собственных лабораториях, и мы надеемся, что это будет способствовать быстрому внедрению этой технологии.