Визуализация сотовой электрической активности в Zebrafish ранних эмбрионов и опухоли

Общая цель этой процедуры заключается в создании трансгенной линии рыбок данио, которая позволяет наблюдать за клеточными электрическими изменениями во время эмбриогенеза, движения личинок и при генезе опухоли. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области биологии развития, физиологии и биологии раковых клеток, например, какова фундаментальная роль клеточной электрической сигнализации во время эмбриогенеза и в опухолевых клетках? Основное преимущество этой методики заключается в том, что она позволяет нам отслеживать сотовую электрическую сигнализацию в естественных условиях и в режиме реального времени.

После приготовления мРНК транспозазы Tol2 и раствора для инъекций в соответствии с текстовым протоколом, во второй половине дня перед инъекцией, установите от четырех до шести резервуаров для разведения, в которых содержится не менее двух самцов и двух самок. Чтобы уменьшить количество отходов жизнедеятельности рыбы и вызвать реакцию размножения, избегайте кормления рыб во второй половине дня. На следующее утро достаньте приготовленный раствор для инъекций из морозильной камеры при температуре минус 80 градусов Цельсия и положите его на лед.

Потяните за разделители в резервуарах для разведения рыб и дайте рыбам возможность спариваться. Как правило, рыбы откладывают икру в течение 20-30 минут. Во время ожидания с помощью съемника микропипетки со следующими параметрами вытащите иглы из капиллярного стекла.

С помощью лабораторной салфетки сломайте конец иглы и создайте скошенный край. Меньший диаметр предпочтителен для снижения смертности эмбрионов. Как только рыбы отложат икру, соберите их в чашку Петри диаметром 10 сантиметров.

Сразу под микроскопом вскрытия удалите все аномальные эмбрионы и отходы жизнедеятельности рыб. Затем пипеткой поместите оплодотворенные эмбрионы в подготовленную форму для литья под давлением 3%-ной агарозы. Удалите лишнюю воду, чтобы сохранить эмбрионы на месте.

Как только все ряды будут заполнены жизнеспособными эмбрионами, расположите их так, чтобы все отдельные клетки были ориентированы под углом 45 градусов горизонтально по отношению к игле. Это значительно облегчит укол в дальнейшем. Далее, надев перчатки, с помощью загрузочного наконечника пипетки на 20 микролитров удалите пять микролитров подготовленной конструкции из пробирки на лед.

Осторожно вставьте наконечник пипетки в задний конец разорванной капиллярной трубки так, чтобы он начал сужаться, чтобы реагент оказался как можно ближе к наконечнику и вытолкнул его в капилляр. Если пузырьки воздуха все еще остались, встряхните иглу, следя за тем, чтобы не сломать кончик. Вставьте иглу прямо в иглодержатель для микроинъекций и осторожно затяните, пока игла не останется на месте.

Затем отрегулируйте угол примерно до 45 градусов. После того, как игла подготовлена и прикреплена, включите микроскоп и баллон с газовым давлением. Отрегулируйте объем впрыска, используя приблизительно 0,5 фунта на квадратный дюйм для выдержки и 30 фунтов на квадратный дюйм для выброса.

Убедитесь, что раствор выбрасывается из иглы при нажатии на педаль. С помощью ступенчатого микрометра с каплей минерального масла отрегулируйте объем и расход раствора примерно до 10 микрометров в диаметре. Следите за тем, чтобы противодавление позволяло небольшому количеству раствора вытекать из иглы.

Если противодавления недостаточно, капиллярное действие приведет к попаданию жидкости в иглу и разрушению мРНК. После калибровки иглы вставьте иглу в одну клетку оплодотворенных эмбрионов, используя край гелевой выемки, чтобы обеспечить подложку, которая удерживает эмбрион на месте и позволяет игле оказывать давление, не перемещая эмбрион. Как только кончик иглы окажется в одной ячейке, нажмите на педаль, чтобы выпустить нужное количество раствора.

Важно вводить в клетку раствор, а не желток, для получения трансгенных рыбок данио. Повторите этот процесс для всех эмбрионов. По завершении используйте пипетку для переноса объемом 3,4 миллилитра и воду системы Fish, чтобы перенести введенные эмбрионы в промаркированную чашку, промыв их из агарозного выреза.

Храните эмбрионы в инкубаторе с температурой 28,5 градусов Цельсия, чтобы они могли развиваться. Проверяйте в течение дня, чтобы удалить мертвые эмбрионы рыб и заменить воду 0,1% метиленового синего в воде для рыб. Примерно через шесть-восемь часов после инъекции используйте 10 введенных эмбрионов рыб и метод hotshot для подготовки геномной ДНК.

На следующее утро с помощью диссекционного микроскопа с флуоресцентным источником света отсортируйте эмбрионы, показывающие GFP в тканях, не содержащих желтков. Эти эмбрионы должны содержать введенную конструкцию. Проведите акцизный анализ Tol2, чтобы проверить активность транспозона, как описано ранее.

Если вырезанная плазма может быть обнаружена, оставьте введенные эмбрионы рыб и вырастите их. В противном случае повторите синтез мРНК Tol2 и процесс микроинъекции до достижения положительных результатов акцизного анализа Tol2. Чтобы получить изображение эмбрионов данио-рерио, перекрестное мультипликатор поколения F2 рыб-основателей с рыбами дикого типа в отдельных парах.

Соберите эмбрионы рыб на разных желаемых стадиях развития в соответствии с руководством по стадированию рыбок данио. Для ранней стадии выращивания эмбрионов рыб в воде рыбной системы, под зондом для вскрытия, используйте пару щипцов, чтобы тщательно очистить и удалить хорионы. Используйте пипетку для переноса отходов, чтобы перенести несколько эмбрионов в вогнутое предметное стекло с 3%-ной метилцеллюлозой.

Затем с помощью иглы под зондом для вскрытия отрегулируйте эмбрионы в желаемые положения, чтобы увидеть активность клеточного GFP. Для эмбрионов на стадии менее 12 сомитов используйте эпифлуоресцентный составной микроскоп с совместимой камерой и программным обеспечением для визуализации. Для эмбрионов, прошедших стадию 12 сомитов, используйте флуоресцентный диссекционный микроскоп.

Чтобы получить изображение напряжения опухолевых клеток, сначала определите рыб со злокачественными опухолями оболочки периферических нервов или MPNST. Поместите рыбу в чашку Петри диаметром 10 сантиметров и проведите визуализацию всей монтировки. Наконец, после визуализации, препарируйте опухоль перед просмотром электрической активности опухолевой клетки.

При успешной инъекции более 50% введенных эмбрионов проявят некоторую степень GFP в соматических клетках, и большинство из них покажут положительный результат акцизного анализа транспозона Tol2. Здесь были изучены изменения мембранных потенциалов на протяжении всего клеточного цикла во время раннего эмбрионального развития рыбок данио. Как видно на этом видео с интервальной съемкой, клетки гиперполяризуются перед формированием борозды расщепления.

Более того, различные ткани показали различные мембранные потенциалы у эмбрионов рыб в возрасте от одного до трех дней. Например, сомит и нотокорд в целом были гиперполяризованы по сравнению с соседними тканями и органами. У этого двухдневного эмбриона рыбы нервно-мышечная электрическая активность проявляется во время движения с изменениями плотности цвета, соответствующими электрической сигнальной трансдукции.

Изучены биоэлектрические свойства раковых клеток у эмбрионов от скрещивания рыб-репортеров ASAP1 с мутантом RPL35, склонным к спонтанному МПНСТ. По сравнению с окружающими тканями, опухолевые клетки были более поляризованы. После освоения этой техники микроинъекции ее можно сделать примерно за три часа при правильном выполнении.

Пытаясь провести эту процедуру, важно помнить, что эмбрионы рыбок данио должны находиться на стадии одной клетки для достижения идеальных результатов. С его развитием этот метод открывает путь исследователям в области биологии развития и клеточной биологии для изучения in vivo изменений электрической сигнализации у рыбок данио и других модельных организмов. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как создать трансгенную линию данио-рерио методом микроинъекции.