Титрование ELISA как метод, чтобы определить константу диссоциации взаимодействия лигандов рецепторов
15 февраля 2018 г.
Описан подробный протокол для выполнения титрования ELISA. Кроме того представлен Роман алгоритм оценки титрования ELISAs и получить Константа диссоциации связывание растворимых лигандом микротитровальных рецепторами пластины прикол.
Основная цель этой титрационной ЭЛИСА заключается в определении константы сродства двух связывающих партнеров в воспроизводимой и эффективной манере с использованием нового алгоритма. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы не только в области взаимодействия белков с лигандами и исследования рецепторов, но и в прикладных науках о жизни, таких как фармацевтическая исследовательская деятельность и фармакология. Основным преимуществом этой техники является то, что константа сродства взаимодействия рецептор-лиганд может быть легко определена путем титрирования рецептора лигандом на пластинке ЭЛИСА и с использованием нового алгоритма оценки.
Начните процедуру, разбавляя исходный раствор домена А интегрина Альфа 2 до конечной концентрации пять микрограмм на миллилитр в буфере магния хлорида TBS. В этой демонстрации будут использоваться как дикий тип, так и мутантный домен А интегрина Альфа 2. Заполните каждую ячейку ряда на половину площади микротитрационной пластинки 50 микролитрами раствора для покрытия домена А интегрина Альфа 2.
Выполняйте каждую ряд титрирования по крайней мере в дупликатах. В этом примере каждая ряд титрирования выполняется в квадруплетах. Запечатайте пластинку фольгой и оставьте пластинку при четырех градусах Цельсия на ночь.
На следующий день удалите раствор для покрытия и заполните каждую ячейку 15 микролитрами буфера магния хлорида TBS. Удалите раствор для промывания и заполните ячейки новым раствором для промывания. Промывки удалят растворимые молекулы рецепторов, которые не были иммобилизированы на пластиковой поверхности физической адсорбцией.
Следующим шагом является блокировка неспецифических связывающих сайтов, добавляя 50 микролитров раствора 1 процента BSA в буфер магния хлорида TBS в каждую ячейку. Заново запечатайте пластинку и инкубируйте при комнатной температуре в течение одного часа. Пока ячейки микротитрационной пластинки блокируются с BSA, приготовьте серийную разбавленность лиганда Родоцетин.
В этом случае используется начальная концентрация 243 эмали-эрозионного Родоцетина и коэффициент разбавления 2,3. Для восьми титрационных кривых в этом эксперименте приготовьте 920 микролитров раствора Родоцетина на высокой концентрации в одном проценте BSA в магния хлориде TBS в пробирке номер один. Пипеткой залейте 520 микролитров раствора 1 процента BSA в магния хлориде TBS в каждую из других десяти пробирок, помеченных с двух по одиннадцать.
Перенесите 400 микролитров раствора Родоцетина из пробирки в пробирку две. Смешайте обе решения с помощью чате-терации, а затем перенесите 400 микролитров из этой смеси в пробирку три. Продолжайте эту серийную разбавленность до пробирки одиннадцать.
Для успешного проведения этой процедуры важно всегда быстро заполнять каждую ячейку раствором, чтобы убедиться, что ячейки не высыхают. По завершении одночасовой инкубации удалите раствор для блокировки из ячеек микротитрационной пластинки. Немедленно добавьте 50 микролитров раствора Родоцетина из пробирки один в ячейки столбца один, раствор из пробирки две в ячейки столбца два и продолжайте через столбец одиннадцать.
Добавьте 50 микролитров 1 процента BSA и TBS магния хлорида в качестве контроля без лиганда в ячейки столбца двенадцать. Заново запечатайте пластинку и инкубируйте при комнатной температуре в течение часа с половиной. Для удаления не связанных молекул лиганда удалите раствор для связывания и заполните каждую ячейку 50 микролитрами буфера магния хлорида HBS.
Затем удалите буфер HBS и добавьте новый буфер HBS. Для химической фиксации рецептора и связанного лиганда заполните каждую ячейку микротитрационной пластинки 50 микролитрами 2,5 процентного раствора глутаральдегида в буфере магния хлорида HBS. Инкубируйте микротитрационную пластинку при комнатной температуре в течение десяти минут.
Удалите и инактивируйте избыток глутаральдегида, удалив раствор для фиксации и заполнив каждую ячейку 50 микролитрами буфера магния хлорида TBS. Удалите буфер для промывания и добавьте новый буфер для промывания в каждую ячейку. Для начала этой пробы удалите буфер для промывания со всех ячеек микротитрационной пластинки и добавьте в каждую ячейку 50 микролитров раствора первичного антитела, разбавленного в два тысячи в одном проценте BSA TBS магния хлорида.
Заново запечатайте пластинку и инкубируйте ее при комнатной температуре. Удалите раствор первичного антитела со всех ячеек и добавьте в каждую ячейку 50 микролитров буфера магния хлорида TBS. Промойте три раза буфером магния хлорида TBS.
Затем до
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной статье представлен подробный протокол проведения титрующего ИФА для определения константы аффинности рецептор-лигандных взаимодействий. Предложен новый алгоритм для эффективной оценки результатов, который будет полезен при исследовании белковых взаимодействий и в фармакологии.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Биохимия
- Фармакология
Теоретические сведения
- Понимание взаимодействий рецептора и лиганда имеет решающее значение в различных областях биологии.
- Традиционные методы могут отличаться недостаточной эффективностью и воспроизводимостью.
- Титрованиюющий ИФА предлагает систематический подход к измерению аффинности связывания.
- Новый алгоритм улучшает оценку данных для обеспечения более высокой точности.
Цель исследования
- Разработать надежный метод определения констант сродства.
- Облегчить проведение исследований взаимодействий белков с лигандами.
- Создать инструмент для применения в фармацевтике.
Используемые методы
- Разведение A-домена интегрина альфа-2 в буфере TBS с хлоридом магния.
- Покрытие микропланшетов раствором рецептора.
- Использование нового алгоритма оценки для анализа данных.
- Сравнение A-домена интегрина альфа-2 дикого типа и мутантного варианта.
Основные результаты
- Данный метод позволяет легко определять константы сродства.
- Результаты демонстрируют воспроизводимость в различных сериях опытов.
- Новый алгоритм обеспечивает точную оценку взаимодействий при связывании.
- Полученные данные могут оказать влияние на фармацевтические исследования и изучение рецепторов.
Выводы
- Метод титранционного ИФА эффективен для изучения взаимодействий рецептор-лиганд.
- Новый алгоритм значительно повышает эффективность анализа данных.
- Данный подход может способствовать развитию исследований в различных областях прикладных наук о жизни.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для промышленности
Точное определение констант диссоциации рецептора-лиганда имеет важное значение для валидации мишени и оптимизации ведущих соединений при разработке лекарственных препаратов. Данный метод титрационного ИФА, усовершенствованный с помощью нового алгоритма нелинейной регрессии, позволяет проводить воспроизводимые измерения аффинности без графической оценки, что способствует принятию обоснованных решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) на основе данных. Этот подход повышает прогностическую уверенность на ранних этапах поиска за счет количественного определения силы связывания различных вариантов лигандов и мутантных форм рецепторов.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Раннее открытие и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проводить количественное сравнение аффинности связывания лиганда с рецепторами дикого типа и мутантными рецепторами, что способствует проверке гипотез о взаимосвязи между структурой и активностью.
- Практическая ценность: обеспечивает получение прямого значения константы диссоциации на основе исходных данных сигнала, снижая вариативность при ранжировании аффинности.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: позволяет получать стандартизированные кривые титрования для нескольких лигандов одновременно, что обеспечивает возможность параллельного скрининга библиотек соединений с использованием иммобилизованных мишеней.
- Практическая ценность: использует методы детекции, совместимые с ИФА, что позволяет интегрировать процедуру в существующие платформы иммуноанализа для масштабируемого профилирования аффинности.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: Позволяет измерить концентрацию активных связывающих рецепторов наряду с Kd, что дает информацию для прогнозирования связывания с мишенью в системах, релевантных для конкретных заболеваний.
- Практическая ценность: Обеспечивает получение статистически оцениваемых параметров на основе повторных кривых титрования, что поддерживает принятие решений о дальнейшем продвижении с учетом рисков.
Интеграция в конвейер и рабочий процесс
Данный метод вписывается в континуум процесса поиска — от валидации мишени до идентификации ведущих соединений, при этом количественные данные об аффинности позволяют обосновать приоритетность и снизить механистические риски.
- Поиск новых биологических мишеней: Позволяет проверять терапевтические гипотезы путем количественной оценки того, как мутации или модификации изменяют аффинность связывания лиганда.
- Скрининг: Обеспечивает воспроизводимые количественные сигналы связывания, что позволяет надежно оценивать соединения в различных диапазонах концентраций.
- Аналитика: Позволяет вычислять константу диссоциации и концентрацию рецептора с помощью нелинейной регрессии, предоставляя сопоставимые данные для анализа зависимости «структура-активность».
- Трансляционные исследования: Связывает данные о связывании in vitro с доклинической стадией путем характеристики изменений аффинности в мутантных рецепторах, имеющих значение для лекарственной устойчивости.
- Корпоративное повторное использование: Создает универсальную платформу для профилирования аффинности различных пар белок-лиганд, снижая зависимость от низкопроизводительных альтернативных методов.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает достоверность прогнозов взаимодействий между мишенью и лигандом за счет точного определения Kd с помощью алгоритмов.
- Операционная ценность: повышает воспроизводимость и стандартизацию измерений аффинности между различными лабораториями и проектами.
- Стратегическая ценность: повышает эффективность использования капитала, обеспечивая быструю ранжировку лигандов и мутантов по аффинности, что снижает риск неудач на поздних этапах разработки.
- Влияние на портфель: способствует приоритизации кандидатов в лекарственные препараты с учетом рисков на основе количественных данных о связывании и потенциала взаимодействия с рецептором.
Особенности реализации
- Требуется опыт в области очистки белков, проведения иммуноферментного анализа (ELISA) и нелинейного регрессионного анализа с использованием такого программного обеспечения, как GraphPad Prism.
- Необходим доступ к планшетным ридерам, системам дозирования и средствам контроля инкубации для обеспечения воспроизводимости титрования лигандов.
- Требуется межкомандная стандартизация условий буфера, блокирующих агентов и протоколов фиксации для минимизации вариабельности.
- Предусматривается необходимость адаптации метода при применении к различным парам рецептор-лиганд, особенно в отношении эффективности иммобилизации и стабильности лигандов.
- Включает такие практические ограничения, как возможность нарушения структуры эпитопа при фиксации глутаровым альдегидом, что должно быть эмпирически подтверждено для каждой целевой пары.
Часто задаваемые вопросы по биофармацевтике
Chapters in this video
0:04
Title
0:45
Immobilization of the Receptor (Integrin α2A-domain) to a Microtiter Plate
2:09
Preparation of a Serial Dilution Row of the Ligand (Rhodocetin)
3:25
Binding of Ligand at Different Concentrations to Immobilized Receptor
5:03
Quantification of Receptor-bound Ligand by ELISA
7:06
Evaluation of the Titration Signals
10:58
Conclusion
9:30
Results: Rhodocetin Binds with Lower Affinity to Mutant Integrin α2A-domain
