Имплантация Electrospun сосудистых имплантатов с оптимизированной структурой в мышиной модели
27 июня 2018 г.
Здесь мы представляем модифицированных electrospinning метод изготовления PCL сосудистых имплантатов с толщиной волокон и большие поры, и описать протокол для оценки производительности в естественных условиях в мышиной модели замены брюшной аорты.
Общей целью этого хирургического вмешательства является трансплантация электроспирального сосудистого трансплантата в брюшную аорту крысы и оценка долгосрочной эффективности трансплантата. Этот метод был разработан профессором Делингом Конгом и другими коллегами из нашей группы, и он может помочь ответить на ключевые вопросы в изучении электроспиральных сосудистых трансплантатов, такие как влияние структуры и поверхностных свойств трансплантата на регенерацию сосудов. Основным преимуществом данной методики является то, что она обладает хорошей повторяемостью и высокой выживаемостью животных.
Кроме того, животная модель проста в управлении при низких затратах. Эту работу будет вести наш коллега, доктор Ванг. Для начала приготовьте полимерный раствор, растворив поликапролактон в смеси метанола и хлороформа в соотношении 1:5 и перемешав его при комнатной температуре в течение 12 часов.
Загрузите полимерный раствор в стеклянный шприц объемом 10 миллилитров, и вооружите его тупой иглой 21 калибра. Затем поместите оправку из нержавеющей стали на инструмент для сбора и убедитесь, что он правильно заземлен. Отрегулируйте рабочее расстояние от кончика иглы до коллектора на 17 сантиметров для 25% раствора поликапролактона.
Затем установите скорость потока на шприцевом насосе на восемь миллилитров в час. Далее установите напряжение на блоке питания на 11 киловольт, и запустите вращение оправки со скоростью 40 оборотов в минуту, чтобы собрать электропрядущие волокна для соответствующего распределения волокна. Теперь, когда все готово, включите источник питания и шприцевой насос, чтобы начать сбор электровращающихся волокон.
Через 4,5 минуты выключите шприцевой насос, блок питания и мотор оправки. Дайте привою высохнуть в капюшоне в течение одного часа. Затем извлеките привой из оправки с помощью абсолютного спирта и поместите его в вакуум на ночь, чтобы удалить остатки растворителя.
Простерилизуйте трансплантат окисью этилена и дайте ему высохнуть в стерильном биологическом капюшоне. Используя стандартные методы, получить SEM-изображения просвета графтов и импортировать их в ImageJ. Используйте измерительные инструменты для измерения диаметра волокна и среднего размера пор на каждом изображении, чтобы обеспечить согласованность образцов.
Чтобы получить информацию о механических свойствах привитого материала, сначала разрезают трубчатый каркас на три миллиметровых участка с помощью бритвенного лезвия. Затем с помощью штангенциркуля измерьте толщину строительных лесов. Затем загрузите леса в захваты машины для испытания на растяжение так, чтобы между захватами оставался один миллиметр.
Удерживайте леса в осевом направлении, со скоростью 10 миллиметров в минуту, до тех пор, пока они не разорвутся. Обязательно запишите как прочность на разрыв, так и предельное удлинение при разрыве для образцов. Перед операцией быстрые самцы крыс Sprague Dawley весом от 240 до 270 граммов в течение 24 часов до операции по имплантации.
Обезболите крысу и подготовьте ее к операции, как описано в сопроводительном текстовом протоколе. Подтвердите адекватную анестезию, убедившись, что у крысы расслаблены мышцы и ровное дыхание. Затем поместите крысу под операционный микроскоп в положение лежа на спине.
С помощью хирургических ножниц выполните лапаротомию по средней линии длиной четыре-пять сантиметров и обнажите брюшную полость. Осторожно втяните и оберните кишки марлей, смоченной солевым раствором. Глядя в операционный микроскоп, отделите брюшную аорту от прилегающих тканей.
Определите и перевяжите все мелкие ветви нисходящей аорты, используя монофиламентные нейлоновые швы 9-0. Далее с помощью сосудистых зажимов зажимают изолированный участок аорты с точностью до одного сантиметра. Затем с помощью микроножниц пересеките брюшную аорту между зажимами.
Промойте оба конца аорты с помощью гепаринизированного физиологического раствора, чтобы удалить остаточную кровь. Отклейте придаток зажатой аорты с помощью микроножниц. Затем поместите участок стерилизованного трансплантата длиной в один сантиметр в щель, образовавшуюся от удаленного участка аорты.
Используя монофиламентные нейлоновые нити 9-0, постройте четыре анастомозы с использованием рисунка шовной нити в форме восьмерки в положении «девять часов», «три часа», «12 часов», а затем «шесть часов» проксимальной стороны. Затем сконструируйте остальные четыре анастомозов между каждым из швов на проксимальной стороне. Поместите трансплантат вертикально, чтобы показать равный интервал между восемью стежками под операционным микроскопом.
После завершения наложения проксимального шва повторите процесс на дистальной стороне. После того, как трансплантат будет прикреплен, снимите дистальный зажим, чтобы кровь могла течь в трансплантат, затем удалите проксимальный зажим. Используя стерильный ватный тампон, надавите, чтобы остановить любое наблюдаемое кровотечение в точках наложения швов.
Давите около трех минут, пока не произойдет гемостаз. Далее верните кишечник в брюшную полость, и промойте брюшную полость с помощью теплого физиологического раствора, содержащего гентамицин. Затем зашейте брюшную стенку с помощью нейлонового шва 3-0 в мышечном и кожном слоях.
Используйте йод на разрезе после операции только один раз. Верните крысу в компанию других, как только она полностью выздоровеет. Концентрация поликапролактона в электроспиннинговом растворе может влиять как на диаметр волокна, так и на механические свойства графтов.
При использовании 25%-ного раствора с более высокой концентрацией образуются сосудистые трансплантаты с более толстыми волокнами и более крупными порами, чем при использовании 10%-ного раствора. После трех месяцев in vivo гистологическое окрашивание выявило слой новой ткани, образовавшийся на просвете трансплантата, и значительный объем отложения коллагена внутри самого трансплантата. Этот новый слой ткани выстлан эндотелиальными клетками, ниже которых находится слой как гладкомышечных клеток, так и окружно выровненного эластина.
После 12 месяцев in vivo новая ткань выглядела хорошо интегрированной, а эндотелиальный и гладкий мышечные слои остались неповрежденными. После освоения эта техника может быть выполнена за один-два часа, если она выполнена правильно. После этой процедуры могут быть выполнены другие меры, такие как цветная допплерография, чтобы ответить на дополнительные вопросы, например, После просмотра этого видео вы должны хорошо понимать, как изготавливать электроспиральные сосудистые трансплантаты, и оценить их эффективность in vivo в модели замены брюшной артерии крысы.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной работе представлен модифицированный метод электроспиннинга для изготовления сосудистых графтов из поликапролактона (PCL) с толстыми волокнами и крупными порами. В протоколе также оценивается эффективность этих графтов in vivo на модели замещения брюшной аорты у крыс.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Биомедицинская инженерия
- Инженерия сосудистых тканей
- Методы электроспиннинга
Теоретическая часть
- Сосудистые графты, полученные методом электроспиннинга, имеют решающее значение для регенерации сосудов.
- Цель исследования — понять влияние структуры и свойств поверхности графта.
- Предыдущим методам не хватало стабильности характеристик графтов.
- Модель на крысах является экономически эффективной и удобной для долгосрочных исследований.
Цель исследования
- Трансплантация электроспиннингового сосудистого протеза в брюшную аорту крысы.
- Оценка долгосрочной эффективности функционирования протеза.
- Оценка воспроизводимости и показателей выживаемости при применении данной хирургической методики.
Используемые методы
- Приготовление полимерного раствора с использованием поликапролактона.
- Растворение PCL в смеси метанола и хлороформа в соотношении от 1:5.
- Перемешивание раствора при комнатной температуре в течение 12 часов.
- Трансплантация графта в модель крысы.
Основные результаты
- Модифицированный метод электроспиннинга позволил получить графты с требуемыми свойствами.
- В ходе исследования наблюдались высокие показатели выживаемости животных.
- Графты продемонстрировали потенциал для эффективной регенерации сосудов.
- Результаты указали на важность структурных и поверхностных характеристик.
Выводы
- В ходе исследования был успешно разработан надежный метод изготовления графтов.
- Оценки in vivo показали многообещающие результаты для применения в сосудистой хирургии.
- Будущие исследования могут основываться на этих данных для улучшения характеристик графтов.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Электропряльные сосудистые графты с оптимизированной макропористой структурой решают ключевую проблему в инженерии сосудистых тканей: обеспечение инфильтрации клеток и регенерации тканей при сохранении долгосрочной проходимости. Этот подход повышает прогностическую достоверность доклинических моделей, демонстрируя стабильное функционирование графта без неблагоприятного ремоделирования в течение 12 месяцев. Данный метод представляет собой воспроизводимую и экономически эффективную модель на крысах для оценки заменителей артерий, что позволяет принимать решения о целесообразности дальнейшего развития проектов по созданию сосудистых графтов.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет исследовать взаимосвязь между структурой и свойствами биоматериалов, в частности, влияние диаметра волокон и размера пор на регенерацию сосудов.
- Практическая ценность: предлагает стандартизированную, воспроизводимую хирургическую методику с высоким уровнем выживаемости животных, что снижает вариативность в доклинических исследованиях.
Скрининг и разработка методов анализа
- Научная ценность: позволяет создавать трансплантаты с количественно определяемыми структурными параметрами (толщина волокон ~5-6 μm, размер пор ~30 μm), которые коррелируют с функциональными результатами, такими как врастание клеток и отложение коллагена.
- Практическая ценность: способствует стандартизации изготовления и оценки трансплантатов, обеспечивая готовность анализа для сравнительного скрининга биоматериалов.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: демонстрирует долгосрочную проходимость, интеграцию в ткани, а также отсутствие кальцификации или формирования аневризмы, что обеспечивает механистическое снижение рисков для кандидатов на роль сосудистых протезов.
- Практическая ценность: позволяет проводить лонгитюдную оценку с помощью ультразвукового исследования и гистологии, что способствует принятию обоснованных с учетом рисков решений о продвижении препаратов/изделий в рамках доклинических исследований.
Интеграция конвейера и рабочего процесса
Данный метод вписывается в континуум от открытия до доклинических исследований, обеспечивая оценку биоматериалов на ранних стадиях посредством длительных исследований по имплантации в клинически релевантной модели замены артерии.
- Фундаментальная биология: способствует проверке гипотез о том, как архитектура трансплантата влияет на регенерацию и ремоделирование сосудов.
- Скрининг: обеспечивает стандартизированное производство и оценку электроспининговых трансплантатов с настраиваемыми структурными свойствами для сравнительного анализа.
- Аналитика: предоставляет количественные данные, включая предел прочности на разрыв, диаметр волокон, размер пор, проходимость по данным УЗИ и гистологическую интеграцию тканей.
- Трансляционные исследования: демонстрирует непрерывность процесса от острой имплантации до долгосрочного ремоделирования тканей, что соответствует конечным точкам доклинической валидации.
- Корпоративное повторное использование: создает универсальную платформу для оценки различных электроспининговых биоматериалов в сосудистых приложениях.
Операционное и организационное воздействие
- Научная ценность: Прогностическая уверенность в эффективности трансплантата благодаря подтвержденной регенерации тканей и отсутствию неблагоприятного ремоделирования.
- Практическая ценность: Высокая воспроизводимость, низкая стоимость и простота управления на моделях крыс поддерживают возможность масштабируемого доклинического тестирования.
- Стратегическая ценность: Обоснование более точных решений о продолжении или прекращении разработки («go/no-go») за счет снижения биологических рисков на поздних стадиях благодаря долгосрочной функциональной валидации.
- Влияние на портфель проектов: Обеспечивает приоритезацию кандидатов на сосудистые трансплантаты с поправкой на риск на основе структурной оптимизации и долговечности in vivo.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы с методами электроспиннинга, сосудистой хирургией и характеризацией биоматериалов.
- Необходимо оборудование для электроспиннинга, испытаний на растяжение, СЭМ-визуализации и ультразвукового мониторинга.
- Требуется стандартизация протоколов изготовления графтов, хирургической имплантации и послеоперационного анализа.
- Необходимо учитывать особенности адаптации при переходе от моделей на крысах к более крупным доклиническим системам.
- Практические ограничения включают необходимость стерильной обработки, удаления растворителя и стерилизации этиленоксидом для обеспечения безопасности графтов.
