Microfluidic платформа для продольной Imaging в Caenorhabditis elegans

Общая цель этой процедуры заключается в продольном изображении динамических процессов у взрослых нематод в контролируемых условиях окружающей среды для отслеживания поведенческих реакций червей и кинетики экспрессии генов червей. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы о том, как животные адаптируются к изменениям в окружающей среде, включая различия в основном поведении, экспрессии генов, памяти и обучении. Этот метод позволяет проводить мультиплексное продольное наблюдение за отдельными животными в динамически контролируемых условиях, а также одновременную выборку нескольких аспектов адаптации с высоким разрешением.

Применение этого метода распространяется на количественное понимание адаптации животных, поскольку получение высокоточных кинетических данных может облегчить математическое моделирование, а также формулирование и проверку сложных гипотез. Чтобы настроить устройство для проведения процедуры, сначала подсоедините выходной наконечник шприца к 50-сантиметровому отрезку шприцевой трубки. Чтобы сделать переходную иглу, с помощью плоскогубцев вытяните стержень иглы из ступицы иглы 20 калибра на полдюйма и используйте горелку Бунзена для удаления остатков пластика.

Удерживая оба конца иглы плоскогубцами, согните переходную иглу в соответствии с геометрией экспериментальной установки и вставьте иглу наполовину в другой конец выходной трубки шприца. Затем подсоедините один наконечник входного шприца непосредственно к трехходовому клапану и подсоедините входной шприц буфера к отрезку трубки для шприца длиной в один метр. Вставив иглу адаптера наполовину в открытый конец трубки, подсоедините шприц для замены буфера к 50-сантиметровому отрезку трубки шприца через наконечник шприца.

Подсоедините трубку шприца к оставшемуся отверстию трехходового клапана и закройте клапан. С помощью переходной иглы подсоедините шприц для впуска червя к метровой трубке шприца, как показано выше. Затем дважды промойте все материалы S-medium и наполните промытые шприцы и трубки свежим S-medium, стараясь удалить любые пузырьки воздуха.

Теперь подсоедините выходную трубку шприца к выходному отверстию устройства и вставьте переходную иглу на конце выпускной трубки шприца в выходное отверстие. Введите небольшой объем S-среды через выпускное отверстие, чтобы заполнить устройство, пока S-среда не выйдет из входных отверстий буфера и червяка. Подсоедините трубку входного шприца буфера к входному порту буфера устройства и заткните входное отверстие червяка установочным штифтом из нержавеющей стали диаметром в тридцать секунду дюйма.

Установите микрофлюидное устройство на инвертированный флуоресцентный микроскоп с моторизованным предметным столиком и прикрепите шприцевой насос к вибростенду рядом с микроскопом, чтобы насос не трясся во время встряхивания. Затем загрузите входной шприц буфера в шприцевой насос и настройте насос на подачу непрерывного потока S-среды в устройство со скоростью потока три микролитра в минуту. Чтобы загрузить бактерии в микрофлюидное устройство, сначала загрузите новый шприц с суспензией E.coli OP50 высокой плотности.

Поверните шприц вертикально и несколько раз постучите по стволу, чтобы собрать все пузырьки воздуха в верхней части шприца. Выключите орбитальный шейкер и закройте трехходовой клапан входных шприцев буфера. Замените входной шприц буфера шприцем, наполненным бактериями, и вытолкните весь воздух, собранный в верхней части шприца, до тех пор, пока небольшое количество бактериальной суспензии не попадет в буферную систему обмена и в шприце, загруженном OP50, или клапане не останется пузырьков.

При закрытом клапане подсоедините шприц, наполненный бактериями, к шприцевому насосу и включите орбитальный шейкер. Установите скорость встряхивания примерно на 200 об/мин и скорость потока на 100 микролитров в минуту. После того как буфер OP50 распространится по всему устройству, установите скорость потока обратно на три микролитра в минуту.

Чтобы загрузить устройство нематодами, сначала заполните пробирку микроцентрифуги объемом 650 микролитров 100 микролитрами свежей суспензии OP50 и с помощью червячной кирки по отдельности перенесите от 20 до 30 молодых взрослых червей, синхронизированных по возрасту, с агаровой пластины для роста нематоды в пробирку. Наполните шприц и шприцевую трубку свежей суспензией OP50 и введите примерно 500 микролитров суспензии в микроцентрифужную пробирку. Затем наберите суспензию червя в трубку шприца для впуска червя и подсоедините шприц для впуска червя к входу червя.

Введите всех червей через трубку для впуска червя в микрофлюидное устройство и отсоедините шприц для впуска червя и трубку для шприца. Закупорьте впускное отверстие червяка штифтом и отсоедините впускной шприц буфера от механического насоса. Используйте входной шприц буфера для ручного перемещения червей в каналы, а выходной шприц для обратного движения червей при необходимости.

Погрузка животных требует некоторой координации. Используйте легкие нажатия на поршни шприца, чтобы выровнять их по каналу, и несколько более сильный нажим, чтобы загнать червя до упора. Затем дайте червям приспособиться к новой среде в течение двух-трех часов, прежде чем начать эксперимент.

Черви ограничены своими каналами, но они не обездвижены. Большинство червей остаются в своих каналах в течение всего эксперимента, но некоторые могут ускользнуть или запутаться в микротрещинах. Здесь можно наблюдать яркие полевые изображения одного репрезентативного червя в течение десяти часов в устройстве.

При использовании трансгенных червей, экспрессирующих GFP в соответствии с одним из промоторов гена иммунного ответа, при инфекции P.Aeruginosa, PA14, экспрессия GFP наблюдается в средней части тела и хвосте червя в течение первых пяти часов контакта с патогеном, увеличиваясь до устойчивой экспрессии всего тела в течение следующих пяти часов. Построение графика общей флуоресценции каждого червя в зависимости от времени после заражения иллюстрирует динамику индукции одного гена иммунного ответа, а также вариабельность от червя к червю в сроках и степени индукции. Покадровая визуализация яиц, отложенных червями в каждом канале, позволяет построить график совокупного количества яиц, отложенных каждым червем в зависимости от времени после заражения, и фиксирует изменчивость животного к животному, а также вызванное патогеном снижение яйцекладки по мере прогрессирования инфекции.

После освоения микрофлюидное устройство может быть подготовлено и загружено за один час. После того, как устройство загружено и черви акклиматизированы, другие реагенты, такие как конкретные лекарства или химические сигналы, представляющие интерес, могут быть доставлены червям, чтобы ответить на дополнительные вопросы о контроле нейронов и генетических систем нематоды. После его разработки мы и наши коллеги использовали эту технику для анализа пищевого поведения нематод, а также генетических реакций червей на инфекцию теплового шока и голод в различных условиях.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как использовать микрофлюидное устройство для выполнения продольных эссе.