Optogenetic ГРЭС гиппокампа тета колебаний в себя мышей

Мы описывают использование Оптогенетика и электрофизиологические записей для селективного манипуляции гиппокампа тета колебаний (5-10 Гц) в себя мышей. Эффективность ритм ГРЭС контролируется с помощью местных месторождений. Сочетание опто - и фармакогенетических ингибирование адреса эфферентной индикация гиппокампа синхронизации.

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области нейрофизиологии, такие как причинная роль тета-колебаний в специальной навигации и связанное с этим поведение. Основное преимущество этой методики заключается в том, что она позволяет в режиме реального времени контролировать частоту и регулярность тета-колебаний гиппокампа у мышей, ведущих себя. Демонстрировать процедуру будет доктор Франциска Бендер, бывшая аспирантка моей лаборатории.

Начните с полностью обезболенной мыши, закрепленной в стереотаксической рамке. Просверлите отверстие над медиальной перегородкой. Погрузите кончик инъекционной иглы в каплю вируса на кусок парафиновой пленки и осторожно наберите вирус со скоростью около 500 нанолитров в минуту, наблюдая за уровнем жидкости.

Чтобы предотвратить попадание воздуха внутрь иглы, прекратите забор до того, как вирус полностью впитается. Очистите иглу бумажной салфеткой. Убедитесь, что вирус и масло отделены пузырьком воздуха, и отметьте уровень вируса на трубке.

Расположите иглу над местом трепанации черепа и медленно введите ее в мозг в точке первой инъекции. Введите 450 нанолитров вируса со скоростью от 100 до 150 нанолитров в минуту. После инъекции подождите 10 минут.

Через 10 минут осторожно переместите иглу вверх на 0,1 миллиметра и подождите еще пять минут. Используйте микростриппер для снятия 125 микрометров оболочки с многомодового оптического волокна, пока волокно все еще прикреплено к катушке с оптоволоконным кабелем. Затем с помощью алмазного ножа разрежьте волокно до длины примерно два-три сантиметра.

Вставьте оптическое волокно в керамический наконечник из диоксида циркония с внутренним диаметром 126 мкм. Примерно от 0,5 до одного миллиметра волокна должно выступать из выпуклой стороны наконечника. С помощью иглы нанесите по одной капле эпоксидного клея на оба конца наконечника, но не на боковые стороны наконечника.

После высыхания используйте алмазную притирочную пленку для полировки волокна с зернистостью три микрона для полировки выпуклой стороны наконечника. Чтобы подготовить массив из вольфрамовой проволоки, сначала приклейте несколько направляющих для трубок из кремнезема толщиной 100 микрон к липкой стороне куска ленты. Затем с помощью щипцов продеть изолированные формваром вольфрамовые проволоки толщиной 45 микрон через направляющие трубки.

Затем с помощью скальпеля снимите изоляцию с обоих концов шестиэмалевых изолированных тонких медных связующих проводов длиной около пяти миллиметров. Затем снимите изоляцию с обоих концов заземляющего провода длиной примерно два-три сантиметра. Припаяйте каждый зачищенный провод к контактам наноразъема.

Подсоедините каждый соединительный провод к одному вольфрамовому проводу, используя одну каплю серебряной проводящей краски. После высыхания нанесите небольшое количество цемента, чтобы покрыть медные провода. Избегайте нанесения цемента на верхнюю часть наносоединителя.

Дав цементу высохнуть не менее 30 минут, используйте тупые ножницы из нержавеющей стали, чтобы разрезать вольфрамовую проволоку под углом от пяти до 20 градусов. Начните с сверления четырех отверстий диаметром 0,8 мм в чистом черепе животного, находящегося под наркозом. Просверлите два отверстия рострально к коронковому шву, а два над мозжечком.

Далее установите костные винты из нержавеющей стали для заземления и стабилизации имплантата. Расположите винт заземления, соединенный с медным проводом, над мозжечком. Полностью заземлите винт заземления цементом, чтобы предотвратить мышечные артефакты во время электрофизиологической записи.

Соорудите кольцо, соединяющее все винты. Выполните трепанацию черепа над местом имплантации, затем нанесите примерно один микролитр стерильного физиологического раствора на поверхность мозговой ткани. Используйте стереотакс, чтобы медленно опустить решетку проводов в краниотомию.

Затем нанесите примерно пять микролитров теплого жидкого воска над местом имплантации для защиты тканей мозга. Нанесите цемент вокруг проволочного массива и залейте череп цементом. Нанесите одну каплю флюса на предварительно припаянный заземляющий провод или предварительно припаянный провод, подключенный к винту заземления, и соедините провода с помощью паяльной машины.

Наконец, закройте весь провод заземления цементом. Проверьте светоотдачу от патч-корда. Если скорость пропускания имплантированного волокна составила 50%, убедитесь, что светоотдача на кончике патч-корда составляет 20 милливатт.

Подключите предусилитель головной ступени к имплантированному разъему, а оптоволоконный патч-корд подсоедините к имплантированному волокну гиппокампа для оптогенетической стимуляции. Запишите поведение базового плана на время, соответствующее измеряемым параметрам. Откройте программу для управления генератором стимулов.

Нажмите кнопку «Файл», откройте и выберите нужный файл протокола. Нажмите «Скачать» и начните инициировать световую стимуляцию. Наблюдайте за контролем тета-ритма с помощью световых импульсов.

Здесь виден потенциал локального поля гиппокампа во время спонтанных тета-колебаний. Обратите внимание на гамма-огибающие, индикатор физиологического тета-ритма. Здесь виден потенциал локального поля гиппокампа на частоте семь герц во время оптогенетического увлечения.

Синими полосами обозначены временные окна подачи света. Обратите внимание на сброс фазы световым импульсом, обозначенным здесь стрелкой. Потенциал локального поля гиппокампа на частоте 10 Гц отражает оптогенетическую синхронизацию.

Обратите внимание, что гамма-огибающие с фазовой автоподстройкой частоты и обращение фазы между стратхорианами и лучистым слоем также поддерживаются во время уноса. После освоения эта техника может быть выполнена за четыре часа эксперимента плюс шесть недель для вирусной экспрессии. Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить об обеспечении эффективной вирусной трансдукции.

Правильно подключите оптоволоконный имплантат к патч-корду и получите хорошее качество спонтанных тета-колебаний потенциала локального поля.