Расширение редактирования с Cas9 рибонуклеопротеида в различных клеток и организмов геном

Общая цель этого протокола заключается в проведении целенаправленных геномных изменений в различных клетках и организмах с использованием рибонуклеопротеиновых комплексов CRISPR/Cas9. Этот метод может помочь в решении фундаментальных биологических вопросов, предоставляя исследователям возможность генерировать специально разработанные вставки, делеции и замены в немодифицированных геномах модельных и немодельных организмов. Основное преимущество использования рибонуклеопротеинов или комплексов РНП вместо плазмидной ДНК заключается в том, что эффективность выше, а побочные события снижаются.

Применение этого метода распространяется на терапию ex vivo для борьбы с такими вещами, как рак, ВИЧ или генетические заболевания. Это связано с тем, что редактирование генома может быть использовано для коррекции вредных мутаций или даже повышения способности клеток бороться с вредными заболеваниями. Таким образом, этот метод может дать представление о первичных клетках человека, C.elegans и Parhyale hawaiensis.

Он может быть применен для внесения генетических изменений в сотни других систем, включая ранее неподатливые организмы. Начните эту процедуру с проектирования и подготовки направляющей РНК, как описано в текстовом протоколе. Соберите комплекс РНП, смешав одно-двукратное молярное количество направляющей РНК с 200 пикомолами белка Cas9 в общем объеме 10 микролитров.

Очень медленно добавляйте концентрированный Cas9 к направляющей РНК в течение примерно 30 секунд, делая быстрые круги пипеткой. Доводим конечную концентрацию Cas9 до 20 микромоляров. Далее добавьте по 10 микролитров РНП в каждую кюветную лунку.

После подготовки ГСКК в соответствии с текстовым протоколом подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра и перенесите от 150 000 до 200 000 клеток на кювету для электропорации в центрифужную трубку. Вращайте трубку со скоростью, в 100 раз превышающей силу тяжести, в течение 10 минут, чтобы гранулировать клетки. Отсадите надосадочную жидкость с помощью пипетки или вакуума, удаляя любые пузырьки.

Аккуратно ресуспендируйте ячейки с помощью 20 микролитров электропорационного буфера на каждую кюветную лунку. Затем добавьте 20 микролитров клеток, которые содержат от 150 000 до 200 000 HSPC, в каждую кюветную лунку, которая уже содержит 10 микролитров RNP, и хорошо перемешайте путем пипетирования вверх и вниз без образования пузырьков. Наконец, электропорируйте кюветы после помещения их в нуклеофектор.

Для HSPC используйте импульсный код ER-100. Начните с приготовления C.elegans в агарозных подушечках, как описано в текстовом протоколе. Поместите агарозную инъекционную подушечку и крышку на эндоскоп для вскрытия.

С помощью червячной кирки проложите небольшую дорожку галоуглеродного масла вдоль одного края подушечки. Затем с помощью червячной кирки, покрытой маслом, поднимите несколько червей с пластины NG агара в масляную дорожку. С помощью тонкого волоска, прикрепленного к пипетке, например, ресницы или кошачьего уса, расположите червей параллельно, осторожно проталкивая червей в агарозную подушечку.

До тех пор, пока вы не освоитесь с процедурой микроинъекции, вставляйте только одного червя за раз. Оказавшись на месте и прикрепив его к подушечке, нанесите на червей еще несколько капель галогуглеродного масла с кончика червячной кирки. Поместите крышку с установленными червячками на инъекционный микроскоп.

При малом увеличении расположите червей перпендикулярно инъекционной игле, заполненной раствором РНП, как описано в текстовом протоколе. Переключитесь на большое увеличение и переместите иглу рядом с плечом гонады, соответствующей области рядом с ядрами в среднем и позднем пахитене. С помощью микроманипулятора переместите иглу против червя, слегка надавливая на кутикулу.

Затем одной рукой постучите по боковой стороне предметного стекла микроскопа, чтобы встряхнуть иглу через кутикулу. Нажмите на лопатку или кнопку для инъекций, медленно заполните плечо гонады инъекционной смесью и извлеките иглу. Повторите этот шаг с другим плечом гонад.

После того, как черви будут введены внутрь, снимите защитный листок и агарозную прокладку и поместите ее под препарирующий микроскоп. С помощью вытянутой капиллярной пипетки вытесните масло из червей, наложив на них пипетирование буфера M9. Выполняйте эту обработку, чтобы освободить глистов от агара.

Через 10 минут, когда черви начнут метаться в буфере, переместите их на назогастральный агаровый планшет с бактериями OP50 с помощью вытянутой капиллярной пипетки. Поместите пластину при температуре 20 градусов Цельсия на два-три часа, пока черви не восстановятся и не начнут двигаться. После восстановления по отдельности перенесите червей в назогажные агаровые пластины с OP50.

Затем перенесите планшеты в инкубатор с температурой 25 градусов Цельсия. Соберите одноклеточные эмбрионы Parhyale через 0-4 часа после оплодотворения, сначала обезболив беременных самок 0,02% гвоздичным маслом и морской водой. Осторожно соскребите эмбрионы из ее брюшного выводкового мешка с помощью стеклянной пипетки с закругленным пламенем и тупой пары щипцов номер три.

Используя сжатый азот, ввести эмбрионы пархьяле под препарирующий микроскоп с помощью микроинъектора и микроманипулятора. Загрузите 1,5 микролитра инъекционной смеси в заднюю часть натянутой капиллярной трубки с помощью наконечника для пипетки с микрозагрузчиком. Установив иглу на инъекционный аппарат, сломайте кончик иглы с помощью пары щипцов под препарирующим эндоскопом.

Откалибруйте подаваемый объем путем впрыска в галоуглеродное масло 700 и измерения диаметра пузырька. Вырежьте корыто из отвердителя с помощью лезвия бритвы. Заполните его наполовину стерилизованной фильтром морской водой и выложите эмбрионы пархьяле в корыто для инъекций.

Вводите эмбрионы с помощью установки для микроинъекций, стабилизируя каждый эмбрион с помощью пары щипцов во время инъекции. После инъекции используйте стеклянную пипетку для переноса, чтобы перенести эмбрионы в свежую 60-миллиметровую чашку для культивирования, заполненную наполовину стерилизованной фильтром морской водой, прежде чем препарировать и зафиксировать эмбрионы на различных стадиях. Сделайте иглы для рассечения, продев изогнутый кусок вольфрамовой проволоки длиной примерно 0,5 дюйма в конец инсулиновой иглы.

Используйте одномиллилитровый шприц в качестве ручки иглы для вскрытия и заточите иглу в гидроксиде натрия под действием тока. Заполните одну лунку из трехлуночной стеклянной чашки наполовину свежеприготовленным раствором, состоящим из девяти частей буфера PEM, одной части 10X PBS и одной части 32% PFA. Поместите в чашку от трех до пяти эмбрионов и проделайте небольшое отверстие в каждом эмбрионе, используя острую вольфрамовую иглу для прокалывания и слегка притупленную для стабилизации, позволяя желтку вытекать и закрепляющему средству проникать внутрь.

С помощью пары заостренных вольфрамовых игл аккуратно оторвите две внешние мембраны, окружающие эмбрион пархьяле. Рассекайте их в фиксаторе, чтобы сделать эмбрионы более крепкими, но работайте быстро, чтобы не допустить фиксации мембраны к эмбриону, что затрудняет удаление мембраны. Дайте эмбрионам закрепиться в общей сложности от 15 до 20 минут для окрашивания антителами или от 40 до 50 минут для гибридизации in situ.

Иногда результаты эксперимента по редактированию лучше всего оценить с помощью экспериментального анализа. Здесь приведены репрезентативные результаты как диких Т-клеток, так и нокаутирующих клеток CD25. Проточная цитометрия показывает, что клетки, которые не были отредактированы с помощью Cas9 RNP, экспрессируют CD25.

Однако клетки, в которых CD25 был нокаутирован, не экспрессируют белок. Для крупномасштабных возмущений результаты редактирования могут иметь четкие визуальные фенотипы. Например, дикий вид Parhyale hawaiensis имеют нормальное брюшко с плавательными и якорными ногами.

Нарушение работы гена Abd-B заменяет брюшные плавательные и якорные ноги на прыжковые и ходячие ноги, которые обычно связаны только с грудной клеткой. В дополнение к проверке фенотипов, экспериментаторы также должны анализировать генотип, чтобы оценить общую эффективность редактирования и обнаружить конкретные генетические изменения. Для одиночных клонов это может быть достигнуто с помощью простого секвенирования по Сэнгеру.

В смешанных популяциях клеток рекомендуется более продвинутый анализ секвенирования. Например, TIDE может отображать все различные инделы, которые произошли в отдельных клетках в отредактированном пуле RNP. При первой попытке выполнить эту процедуру попробуйте использовать один из положительных элементов управления, перечисленных в таблице 1.

Использование проверенной и надежной направляющей РНК может помочь вам получить представление о редактировании с помощью RNP, прежде чем планировать свой собственный эксперимент.