Отслеживание дрозофилы личиночной поведение в ответ на Optogenetic стимуляции обонятельных нейронов
March 21st, 2018
Этот протокол анализирует навигационных поведение дрозофилы личинка в ответ на одновременное optogenetic стимуляции обонятельных нейронов. Свет 630 Нм длины волны используется для активации отдельных обонятельных нейронов, выражая родопсин смещается красный канал. Личинок движение одновременно отслеживается, цифровой записали и анализируются с помощью пользовательской программы.
Общая цель данной методики заключается в анализе навигационного поведения личинки дрозофилы в ответ на одновременную оптогенетическую стимуляцию ее обонятельных нейронов. Этот метод позволяет всесторонне проанализировать функцию обонятельной цепи и дополняет исследования о том, как функция обонятельной цепи преобразуется в поведенческую реакцию. Основным преимуществом этой методики является ее специфичность и временной контроль за счет использования света вместо традиционных градиентов запаха для активации отдельных обонятельных нейронов.
Чтобы начать эксперимент, постройте арену лишенного света поведения. Соорудите коробку размером 89 на 61 на 66 сантиметров, изготовленную из акриловых листов черного цвета из оргстекла, толщиной три миллиметра. Поставьте коробку на столешницу в комнате для поведения.
Затем установите монохромную ПЗС-камеру USB 3.0 с ИК-фильтром Longpass 830 нанометров и восьмимиллиметровым объективом с байонетом F1.4 C в центр потолка черного ящика. Поместите две инфракрасные светодиодные ленты на столешницу, чтобы подсветить личинок в темноте арены. Затем получите квадратную алюминиевую пластину размером 22 на 22 сантиметра для создания светодиодной платформы.
В центре пластины с помощью резака по металлу вырезайте отверстие, достаточно большое, чтобы поместиться вокруг ПЗС-камеры. Накройте металлическую пластину красной светодиодной лентой. Последовательно припаяйте провода светодиодной ленты и подайте провода полосы в реле оптронов, управляемое микропроцессором Raspberry Pi 2B.
Далее установите светодиодную платформу вокруг ПЗС-камеры. Затем установите и настройте операционную систему на базе Ubuntu MATE Raspbian Jessie Linux на процессоре Raspberry Pi перед подключением реле оптроны к светодиодным лентам. Подключите источник питания для питания светодиодных лент и оптроны.
Обеспечьте равномерное излучение в различных точках вокруг ПЗС-камеры на поведенческой арене. Обеспечьте абсолютное излучение на поверхности арены с помощью спектрометра и определите его как примерно 1,3 Вт на квадратный метр по всей поверхности арены. Поддерживайте содержание мух на стандартном корме для мух при температуре 25 градусов Цельсия и относительной влажности от 50 до 60% в течение 12-часового, 12-часового цикла свет/темнота.
Для того, чтобы экспрессировать CsChrimson в одной паре ORNs, скрестите девственных самок из линии UAS-IVS-CsChrimson с самцами из линии ORX-GAL4. После того, как самцу и самке мухи в скрещивании было позволено спариваться и откладывать яйца в течение 48 часов, переложите взрослых особей в свежий флакон. На поверхность пищевого флакона, содержащего яйца, добавьте 400 микролитров смеси, содержащей 400 микроляров полностью транс-ретиналь, или ATR, растворенных в диметилсульфоксиде, или ДМСО, в 89 миллимолярах сахарозы, растворенной в дистиллированной воде.
После добавления ATR в флаконы с пищевыми продуктами, содержащие яйца, инкубируйте флаконы в темноте еще 72 часа. После инкубации извлеките личинки третьего возраста с поверхности корма для мух, поместив их на воду с использованием 15%-ного раствора сахарозы высокой плотности. С помощью микропипетки P1000 отделите личинок, плавающих на поверхности раствора сахарозы, в стеклянный стакан объемом 1000 миллилитров.
Промойте личинок четыре раза, каждый раз подменяя 800 миллилитров свежей дистиллированной воды в стеклянном стакане. После окончательной промывки дайте личинкам отдохнуть в течение 10 минут, прежде чем подвергнуть их поведенческому анализу. Для поведенческого анализа поддерживайте постоянную температуру и влажность в комнате для поведенческих анализов.
Приготовьте личиночную среду для ползания, насыпав 150 миллилитров растопленной 1,5%-ной агарозы в квадратную чашку Петри размером 22 на 22 сантиметра. Дайте агарозе застыть и остыть в течение одного-двух часов в чашках Петри, прежде чем использовать их в поведенческом анализе. После того как агароза застынет, перенесите не более 20 подготовленных личинок третьего возраста в центр чашки Петри и накройте чашку Петри крышкой.
Поместите чашку Петри на поведенческую арену под ПЗС-камерой. Включите инфракрасный светодиодный источник света 850 нанометров, чтобы визуализировать личинок на видео. Запустите ПЗС-камеру, чтобы зафиксировать движение личинок.
Наконец, перейдем к обработке и анализу данных. Когда ORN 7a, экспрессирующий CsChrimson, стимулировался светом, наблюдалось значительное уменьшение длины прогона по сравнению с контрольными животными. И наоборот, когда ORN 42a, экспрессирующий CsChrimson, стимулировался светом, наблюдалось значительное увеличение длины прогона по сравнению с контрольными животными.
Мы обнаружили, что для ORN 42a различные временные паттерны световой стимуляции вызывали разные поведенческие реакции. Хотя мы продемонстрировали этот метод для нейронов обонятельных рецепторов первого порядка, наш метод также позволяет использовать его в различных будущих приложениях, таких как измерение влияния нижестоящих нейронов, таких как проекционные нейроны и локальные нейроны, на поведение личинок. Мы ожидаем, что этот метод проложит путь к комплексному препарированию функции обонятельного контура личинок.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Обзор
Этот протокол анализирует поведенческое поведение личинки Drosophila в ответ на одновременную оптогенетическую стимуляцию ее обонятельных нейронов. Он использует свет с длиной волны 630 нм для активации специфических обонятельных нейронов, экспрессирующих сдвинутый в красную область канал родопсин, что позволяет проводить детальные исследования функции обонятельных цепей и поведенческих реакций.
Ключевые компоненты исследования
Область науки
- Поведенческая нейронаука
- Оптогенетика
- Генетика Drosophila
Фон
- Эта методология позволяет изучать связь между функцией обонятельных цепей и поведенческими реакциями.
- Она обеспечивает временной контроль над активацией с помощью света вместо традиционных градиентов запахов.
- Подход облегчает исследование специфических нейронов в обонятельной системе Drosophila.
Цель исследования
- Разобрать функцию обонятельных цепей с точностью.
- Наблюдать за поведенческими реакциями личинок на целевые нейронные стимуляции.
- Предоставить представление о том, как отдельные обонятельные нейроны влияют на выбор пути.
Используемые методы
- Исследование использует специально разработанную арену для анализа движения личинок.
- Личинки Drosophila, экспрессирующие CsChrimson в обонятельных рецепторных нейронах (ORNs), были стимуляированы светом.
- Поведенческий анализ включает подготовку среды для ползания на агарозе и видеозапись движений личинок.
- Существенными этапами являются сооружение арены, монтаж оборудования и подготовка личинок с определенными условиями.
Основные результаты
- Световая стимуляция специфических обонятельных рецепторных нейронов привела к значительным изменениям в длине бега личинок, указывая на различные поведенческие реакции.
- Различные временные паттерны стимуляции вызывали различные эффекты на поведенческое поведение.
- Этот метод готов помочь в будущем исследовании последствий нисходящих нейронных воздействий на поведение личинок.
Выводы
- Исследование демонстрирует новый подход к анализу обонятельных цепей и их поведенческих последствий.
- Это позволяет исследователям изучать специфические роли целевых нейронов в контексте живого организма.
- Эти результаты улучшают наше понимание нейронных механизмов в обработке чувств и поведении.
Часто задаваемые вопросы
Executive Industry Relevance
This method enables precise dissection of olfactory circuit function by replacing odor stimuli with optogenetic control, addressing a key challenge in target validation where behavioral readouts must be linked to specific neuronal activity. It supports mechanistic de-risking in early discovery by isolating the contribution of individual olfactory receptor neurons to navigational behavior, improving predictive confidence in target selection. The approach enhances translational continuity from molecular target to circuit-level phenotype, relevant for de-risking targets in neuroscience-focused discovery programs.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by linking specific olfactory neuron activation to defined behavioral outputs.
- Operational Value: Provides a reproducible system for functional validation of neuronal targets using light-based stimulation.
- Scientific Value: Supports biological de-risking through isolated manipulation of individual ORNs to clarify their role in larval navigational behavior.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative behavioral readouts (e.g., run length changes) that enable standardized assessment of neuronal modulation effects.
- Operational Value: Establishes a scalable assay platform for screening genetic or pharmacological modulators of olfactory circuit function.
- Scientific Value: Facilitates assay standardization by eliminating odorant volatility and delivery variability through optogenetic stimulation.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports disease-relevant system modeling by enabling dissection of sensory-to-behavior translation in a genetically tractable organism.
- Operational Value: Provides a preclinical-compatible workflow for evaluating neuronal target effects on behavior prior to mammalian validation.
- Scientific Value: Enables mechanistic de-risking by clarifying how upstream neuronal activity translates to downstream behavioral phenotypes.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the early discovery continuum, supporting target validation through behavioral phenotyping and informing lead identification by clarifying neuronal targets that drive measurable outputs.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing of individual olfactory neuron function in driving larval navigational behavior.
- Screening: Delivers quantitative, reproducible behavioral metrics (run length) suitable for compound or genetic modulator evaluation.
- Analytics: Provides trackable behavioral outputs and statistical comparisons between stimulated and control conditions.
- Translational Research: Connects neuronal circuit activity to behavioral responses, supporting extrapolation to higher-order models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for systematic interrogation of neuronal targets across olfactory and other sensory circuits.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing ambiguity in linking neuronal activation to behavioral outcomes.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization through optogenetic control replacing variable odor stimuli.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing clearer mechanistic links between targets and behavioral phenotypes.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on validated behavioral impact in a discovery-relevant system.
Implementation Considerations
- Requires expertise in Drosophila genetics, optogenetics, and behavioral assay design.
- Dependent on specialized instrumentation including behavior arena, IR lighting, CCD camera, and Raspberry Pi-based stimulation control.
- Necessitates cross-team standardization for larval preparation, agarose medium preparation, and video tracking protocols.
- Involves adaptation considerations when extending to different neuronal types (e.g., projection neurons, local neurons) or developmental stages.
- Limited by the need for genetic accessibility and retinal feeding in the model system, which may constrain scalability to non-Drosophila systems.
