Отслеживание дрозофилы личиночной поведение в ответ на Optogenetic стимуляции обонятельных нейронов
21 марта 2018 г.
Этот протокол анализирует навигационных поведение дрозофилы личинка в ответ на одновременное optogenetic стимуляции обонятельных нейронов. Свет 630 Нм длины волны используется для активации отдельных обонятельных нейронов, выражая родопсин смещается красный канал. Личинок движение одновременно отслеживается, цифровой записали и анализируются с помощью пользовательской программы.
Общая цель данной методики заключается в анализе навигационного поведения личинки дрозофилы в ответ на одновременную оптогенетическую стимуляцию ее обонятельных нейронов. Этот метод позволяет всесторонне проанализировать функцию обонятельной цепи и дополняет исследования о том, как функция обонятельной цепи преобразуется в поведенческую реакцию. Основным преимуществом этой методики является ее специфичность и временной контроль за счет использования света вместо традиционных градиентов запаха для активации отдельных обонятельных нейронов.
Чтобы начать эксперимент, постройте арену лишенного света поведения. Соорудите коробку размером 89 на 61 на 66 сантиметров, изготовленную из акриловых листов черного цвета из оргстекла, толщиной три миллиметра. Поставьте коробку на столешницу в комнате для поведения.
Затем установите монохромную ПЗС-камеру USB 3.0 с ИК-фильтром Longpass 830 нанометров и восьмимиллиметровым объективом с байонетом F1.4 C в центр потолка черного ящика. Поместите две инфракрасные светодиодные ленты на столешницу, чтобы подсветить личинок в темноте арены. Затем получите квадратную алюминиевую пластину размером 22 на 22 сантиметра для создания светодиодной платформы.
В центре пластины с помощью резака по металлу вырезайте отверстие, достаточно большое, чтобы поместиться вокруг ПЗС-камеры. Накройте металлическую пластину красной светодиодной лентой. Последовательно припаяйте провода светодиодной ленты и подайте провода полосы в реле оптронов, управляемое микропроцессором Raspberry Pi 2B.
Далее установите светодиодную платформу вокруг ПЗС-камеры. Затем установите и настройте операционную систему на базе Ubuntu MATE Raspbian Jessie Linux на процессоре Raspberry Pi перед подключением реле оптроны к светодиодным лентам. Подключите источник питания для питания светодиодных лент и оптроны.
Обеспечьте равномерное излучение в различных точках вокруг ПЗС-камеры на поведенческой арене. Обеспечьте абсолютное излучение на поверхности арены с помощью спектрометра и определите его как примерно 1,3 Вт на квадратный метр по всей поверхности арены. Поддерживайте содержание мух на стандартном корме для мух при температуре 25 градусов Цельсия и относительной влажности от 50 до 60% в течение 12-часового, 12-часового цикла свет/темнота.
Для того, чтобы экспрессировать CsChrimson в одной паре ORNs, скрестите девственных самок из линии UAS-IVS-CsChrimson с самцами из линии ORX-GAL4. После того, как самцу и самке мухи в скрещивании было позволено спариваться и откладывать яйца в течение 48 часов, переложите взрослых особей в свежий флакон. На поверхность пищевого флакона, содержащего яйца, добавьте 400 микролитров смеси, содержащей 400 микроляров полностью транс-ретиналь, или ATR, растворенных в диметилсульфоксиде, или ДМСО, в 89 миллимолярах сахарозы, растворенной в дистиллированной воде.
После добавления ATR в флаконы с пищевыми продуктами, содержащие яйца, инкубируйте флаконы в темноте еще 72 часа. После инкубации извлеките личинки третьего возраста с поверхности корма для мух, поместив их на воду с использованием 15%-ного раствора сахарозы высокой плотности. С помощью микропипетки P1000 отделите личинок, плавающих на поверхности раствора сахарозы, в стеклянный стакан объемом 1000 миллилитров.
Промойте личинок четыре раза, каждый раз подменяя 800 миллилитров свежей дистиллированной воды в стеклянном стакане. После окончательной промывки дайте личинкам отдохнуть в течение 10 минут, прежде чем подвергнуть их поведенческому анализу. Для поведенческого анализа поддерживайте постоянную температуру и влажность в комнате для поведенческих анализов.
Приготовьте личиночную среду для ползания, насыпав 150 миллилитров растопленной 1,5%-ной агарозы в квадратную чашку Петри размером 22 на 22 сантиметра. Дайте агарозе застыть и остыть в течение одного-двух часов в чашках Петри, прежде чем использовать их в поведенческом анализе. После того как агароза застынет, перенесите не более 20 подготовленных личинок третьего возраста в центр чашки Петри и накройте чашку Петри крышкой.
Поместите чашку Петри на поведенческую арену под ПЗС-камерой. Включите инфракрасный светодиодный источник света 850 нанометров, чтобы визуализировать личинок на видео. Запустите ПЗС-камеру, чтобы зафиксировать движение личинок.
Наконец, перейдем к обработке и анализу данных. Когда ORN 7a, экспрессирующий CsChrimson, стимулировался светом, наблюдалось значительное уменьшение длины прогона по сравнению с контрольными животными. И наоборот, когда ORN 42a, экспрессирующий CsChrimson, стимулировался светом, наблюдалось значительное увеличение длины прогона по сравнению с контрольными животными.
Мы обнаружили, что для ORN 42a различные временные паттерны световой стимуляции вызывали разные поведенческие реакции. Хотя мы продемонстрировали этот метод для нейронов обонятельных рецепторов первого порядка, наш метод также позволяет использовать его в различных будущих приложениях, таких как измерение влияния нижестоящих нейронов, таких как проекционные нейроны и локальные нейроны, на поведение личинок. Мы ожидаем, что этот метод проложит путь к комплексному препарированию функции обонятельного контура личинок.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном протоколе анализируется навигационное поведение личинок Drosophila в ответ на одновременную оптогенетическую стимуляцию их обонятельных нейронов. Для активации специфических обонятельных нейронов, экспрессирующих красномстищий канальный родопсин, используется свет с длиной волны 630 nm, что позволяет детально изучить функционирование обонятельных цепей и поведенческий ответ.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Поведенческая нейронаука
- Оптогенетика
- Генетика Drosophila
Теоретическая часть
- Данная методика позволяет изучить взаимосвязь между функционированием обонятельных цепей и поведенческими реакциями.
- Она обеспечивает временной контроль активации с помощью света вместо традиционных градиентов запаха.
- Этот подход облегчает исследование конкретных нейронов в обонятельной системе Drosophila.
Цель исследования
- Для точного анализа функционирования обонятельных цепей.
- Для наблюдения за поведенческими реакциями личинок на направленную нейронную стимуляцию.
- Для изучения того, как отдельные обонятельные нейроны влияют на выбор направления навигации.
Используемые методы
- В исследовании используется специально разработанная поведенческая арена для анализа движений личинок.
- Личинки Drosophila, экспрессирующие CsChrimson в обонятельных рецепторных нейронах (ORN), подвергались световой стимуляции.
- Поведенческий анализ включает подготовку агарозной среды для ползания и видеорегистрацию движений личинок.
- К ключевым этапам относятся сборка арены, монтаж оборудования и подготовка личинок при соблюдении определенных условий.
Основные результаты
- Световая стимуляция специфических обонятельных рецепторных нейронов привела к значительным вариациям длины пробега личинок, что указывает на различные поведенческие реакции.
- Различные временные паттерны стимуляции вызывали разные эффекты в навигационном поведении.
- Данный метод позволит облегчить дальнейшее изучение влияния нижележащих нейронов на поведение личинок.
Выводы
- Данное исследование демонстрирует новый подход к анализу обонятельных цепей и их влияния на поведение.
- Этот метод позволяет исследователям изучать конкретные функции целевых нейронов в контексте живого организма.
- Полученные результаты углубляют наше понимание нейронных механизмов сенсорной обработки и поведения.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Данный метод позволяет точно проанализировать работу обонятельных цепей, заменив ольфакторные стимулы оптогенетическим контролем, что решает ключевую проблему валидации мишеней, при которой поведенческие показатели должны быть связаны с конкретной нейронной активностью. Метод способствует механистическому снижению рисков на ранних этапах поиска за счет изоляции вклада отдельных обонятельных рецепторных нейронов в навигационное поведение, что повышает прогностическую уверенность при выборе мишени. Такой подход обеспечивает трансляционную преемственность от молекулярной мишени к фенотипу на уровне нейронных цепей, что актуально для снижения рисков при работе с мишенями в программах поиска лекарственных средств, ориентированных на нейронауки.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранние этапы поиска и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы, связывая активацию конкретных обонятельных нейронов с определенными поведенческими реакциями.
- Практическая ценность: обеспечивает воспроизводимую систему функциональной валидации нейрональных мишеней с помощью световой стимуляции.
- Научная ценность: способствует снижению биологических рисков за счет изолированного манипулирования отдельными ORN для уточнения их роли в навигационном поведении личинок.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: позволяет получать количественные показатели поведения (например, изменение длины пробега), что обеспечивает стандартизированную оценку эффектов нейронной модуляции.
- Практическая ценность: создает масштабируемую платформу анализа для скрининга генетических или фармакологических модуляторов функции обонятельных цепей.
- Научная ценность: способствует стандартизации анализа за счет исключения летучести одорантов и вариабельности их доставки благодаря использованию оптогенетической стимуляции.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: Облегчает моделирование систем, имеющих значение для патологий, позволяя детально изучить преобразование сенсорных стимулов в поведение у генетически доступного организма.
- Практическая ценность: Предлагает совместимый с доклиническими исследованиями рабочий процесс для оценки влияния нейронных мишеней на поведение перед валидацией на млекопитающих.
- Научная ценность: Позволяет снизить механистические риски, разъясняя, как нейронная активность на вышележащих уровнях трансформируется в поведенческие фенотипы на нижележащих уровнях.
Интеграция в конвейер и рабочий процесс
Данный метод вписывается в общую концепцию ранних этапов поиска лекарственных средств, обеспечивая валидацию мишеней посредством поведенческого фенотипирования и способствуя идентификации соединений-лидеров за счет уточнения нейрональных мишеней, определяющих измеряемые результаты.
- Фундаментальная биология: позволяет проверять гипотезы о функции отдельных обонятельных нейронов в управлении навигационным поведением личинок.
- Скрининг: обеспечивает получение количественных, воспроизводимых поведенческих показателей (длина пробега), подходящих для оценки соединений или генетических модуляторов.
- Аналитика: предоставляет отслеживаемые поведенческие результаты и возможность статистического сравнения между стимулированными и контрольными условиями.
- Трансляционные исследования: связывают активность нейронных цепей с поведенческими реакциями, что позволяет экстраполировать данные на модели более высокого порядка.
- Повторное использование в исследованиях: создает многократно используемую платформу для систематического изучения нейронных мишеней в обонятельных и других сенсорных цепях.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает прогностическую достоверность за счет снижения неопределенности при установлении связи между активацией нейронов и поведенческими результатами.
- Операционная ценность: Повышает воспроизводимость и стандартизацию благодаря замене вариативных ольфакторных стимулов оптогенетическим контролем.
- Стратегическая ценность: Оптимизирует принятие решений о целесообразности дальнейшей разработки (go/no-go), обеспечивая более четкие механистические связи между мишенями и поведенческими фенотипами.
- Влияние на портфель: Позволяет осуществлять приоритезацию мишеней с учетом рисков на основе подтвержденного поведенческого эффекта в системе, релевантной для процесса поиска новых лекарственных средств.
Особенности реализации
- Требуются экспертные знания в области генетики Drosophila, оптогенетики и разработки поведенческих тестов.
- Зависимость от специализированного оборудования, включая арену для изучения поведения, ИК-освещение, CCD-камеру и систему управления стимуляцией на базе Raspberry Pi.
- Необходима межгрупповая стандартизация процедур подготовки личинок, приготовления агарозной среды и протоколов видеотрекинга.
- Требуются дополнительные корректировки при расширении метода на другие типы нейронов (например, проекционные или локальные нейроны) или стадии развития.
- Ограничено необходимостью генетической доступности и ретинального кормления в модельной системе, что может затруднить масштабирование на системы, отличные от Drosophila.
