Строительство тиоэфиры/Винил сульфид-привязанный винтовой пептиды через фото-индуцированной тиоловых СВ/yne Hydrothiolation

Эти методы упрощают получение тиоэфир-привязанных циклических пептидов благодаря использованию тиоеновой или тио-иновой клик-химии, которая обладает превосходной толерантностью к функциональным группам и хорошим выходом. Основное преимущество этого метода заключается в том, что тиоэфирный трос обеспечивает бесследный сайт модификации, который значительно расширяет химическое пространство стабильных пептидов после модификации пептидного синтеза. Чтобы начать процедуру, прикрепите колонку, заполненную 50 миллиграммами смолы Rink Amide MBHA, к настольному вакуумному коллектору и трубопроводу азота или аргона с помощью трехстороннего запорного крана.

Добавьте от одного до двух миллилитров дихлорметана в слой смолы и набухните смолу, слегка взбалтывая смесь струей пузырьков инертного газа в течение 10 минут. По окончании слейте смолу с помощью резиновой груши-пипетки. Затем добавьте в смолу от одного до двух миллилитров N-концевого раствора для снятия защиты Fmoc.

Аккуратно перемешайте смесь, пузырив инертным газом в течение 10 минут, а затем слейте смолу с помощью резиновой груши-пипетки. Таким же образом промойте колонку одним-двумя миллилитрами ДМФА, а затем одним-двумя миллилитрами ДКМП. Повторите последовательность снятия защиты один раз.

Затем соедините 0,125 миллимоля аминокислоты, защищенной Fmoc, и 50,5 миллиграмма HCTU с 0,5 миллилитрами DMF в полипропиленовом контейнере. Встряхните смесь в течение минуты, чтобы растворились твердые частицы. Затем добавьте 43,5 микролитра DIPEA, и встряхните емкость еще минуту, чтобы получить 0,25-молярный активированный раствор аминокислоты.

Добавьте этот раствор в промытую смолу, и пузырчате инертный газ через смесь в течение одного-двух часов. После этого снимите защиту и промойте остатки связанной аминокислоты. Продолжайте связывать аминокислоты с пептидной цепью таким образом, чтобы получить линейный пептид.

Используйте синтез твердофазного пептида для получения смолы, поддерживающей линейный пептид, который включает тритил-защищенный остаток цистеина, отделенный тремя единицами от остатка моно-S-5. Добавьте от одного до двух миллилитров раствора для снятия защиты тритила с 50 миллиграммами пептидосодержащей смолы. Пузырчатый газообразный азот пропустить через смесь в течение 10 минут.

Слейте раствор для снятия защиты и промойте смолу порциями DCM объемом от одного до двух миллилитров три раза. Повторите процедуру снятия защиты шесть раз или до тех пор, пока раствор не перестанет казаться желтым, чтобы полностью снять защиту с цистеина. Полное снятие защиты с группы Trt цистеина очень важно для следующего этапа фотореакции.

Промойте смолу порциями ДМФА и ДКМП объемом от одного до двух миллилитров в последовательном порядке. Затем замочите смолу в одном-двух миллилитрах метанола на две минуты, чтобы смола уменьшилась. Слейте воду с метанола и высушите смолу с газообразным азотом в течение пяти минут.

Переложите сухую смолу в 10-миллилитровую колбу с круглым дном через бумагу для взвешивания. Суспендируйте смолу в двух миллилитрах азотистого ДМФА. Затем добавьте 5,6 миллиграмма MMP и 38 миллиграммов MAP в качестве фотоинициаторов.

Поместите в колбу мешалку и закройте колбу резиновой перегородкой. Продуйте атмосферу колбы газообразным азотом три раза, общее время продувки составляет около пяти минут. Закрепите реакционную колбу в фотореакторе, оснащенном лампами UVA, входом для инертного азота и мешалкой.

Начните помешивать смесь, и закройте фотореактор. Продуйте фотореактор аргоном в течение 10 минут. Затем установите скорость потока аргона на один литр в минуту и облучайте смесь ультрафиолетовым излучением в течение одного часа при комнатной температуре.

Следите за реакцией с ВЭЖХ. Вымойте, расщепите и очистите циклический пептид по окончании. Приготовьте 50 миллиграммов смолы, содержащей линейный пептид, включающий гамма-замещенный остаток моно-S-5.

Последовательно промойте смолу DMF и DCM. Смолу сожмите метанолом, а высушите газообразным азотом. Затем в 10-миллилитровой колбе с круглым дном суспензируйте смолу в двух миллилитрах азотистого ДМФА.

Добавьте в смесь 5,6 миллиграмма MMP, 3,8 миллиграмм MAP и 25,7 миллиграмм цистеина, защищенного Fmoc. Добавьте в колбу мешалку, запечатайте ее резиновой перегородкой и продуйте атмосферу колбы газообразным азотом. Затем облучите смесь ультрафиолетовым излучением А в фотореакторе, заполненном инертным азотом, перемешивая при комнатной температуре в течение одного-двух часов.

Контролируйте реакцию с помощью ЖК-МС. Когда фотореакция завершится, промойте связанный пептид и проведите реакцию макролактамизации. После этого возобновите связывание аминокислот с циклическим пептидом для формирования желаемой структуры.

Расщепите и очистите пептид, когда закончите. Приготовьте 50 мг смолы, содержащей линейный пептид, который включает остаток с концевым алкином, отделенный тремя единицами от остатка с концевым тиолом. Отделите пептид от смолы, и осадите его одним миллилитром холодного диэтилового эфира.

Центрифугируйте пептидную смесь при 12 000 г в течение двух минут. Аккуратно сцедите надосадочную жидкость, и добавьте еще миллилитр холодного диэтилового эфира. Повторите стирку еще дважды, а затем высушите остатки пептида под вакуумом.

Растворите остаток в 50 миллилитрах азотистого ДМФА в колбе с круглым дном. Добавьте в раствор пептида 3,2 миллиграмма ДМПА и проведите азот через реакционную смесь в течение 10 минут. Инертная атмосфера строго необходима для эффективной тио-иновой фотореакции в фазе раствора.

В противном случае мы наблюдали окисление серы при УФ-облучении. Затем облучите смесь ультрафиолетовым светом без перемешивания в фотореакторе, наполненном инертным азотом, при комнатной температуре от 30 минут до одного часа. По окончании изолируйте и очистите циклический пептид.

Циклизация этого пептида на смоле привела к образованию связанного тиоэфиром одно-пятициклического пептида с молекулярной массой, идентичной линейному пептиду. Время удержания циклического продукта в ВЭЖХ было на две минуты короче, чем у линейного пептида. Хорошая конверсия также наблюдалась при циклизации на смоле нескольких других коротких пептидов.

Линейные пептиды были проверены на способность подвергаться пептидному сшиванию посредством фотоиндуцированного гидротиолирования тиол-ином. Низкий выход двух c был обусловлен конформационным предпочтением захвата тиильного радикала на N-конце во время сжатия до 20-членного макроцикла. Пептиды один a и один b образовали два изомера с восьмичленным винилсульфидным сшивкой.

Пептиды продукта два a-A и два a-B имели различное время удержания и продуцировались в разных соотношениях при разном времени облучения. Протонная ЯМР-спектроскопия показала, что два a-A является E-изомером винилсульфида, а два a-B — Z-изомером. Z-изомер был основным продуктом при образовании двух пептидов d, двух e и двух f, что объяснялось конформационным предпочтением при образовании семичленного винилсульфидного сшивки.

Спектроскопия кругового дихроизма показала случайную спираль для всех форм пептидов два a и два b и спиральную конформацию для пептида two d. Мы разработали ряд химических протоколов для построения тиоэфирных и винилсульфид-привязанных пептидов с использованием фотоиндуцированной тиоеновой и тио-иновой клик-химии. Мы считаем, что это будет полезно для исследовательского сообщества.