Поколение большого числа миелоидного прародителями и дендритных клеток прекурсоров из мышиных костного мозга с помощью Роман ячейку Сортировка стратегия

Этот метод может позволить исследователям получить достаточное количество типов клеток, чтобы ответить на ключевые вопросы в области иммунологии развития. Основное преимущество этого метода заключается в том, что он опирается на несколько выбранных маркеров для выделения большого количества клеток, которые традиционно обнаруживаются в небольших количествах ex vivo. Применение этого метода распространяется и на терапевтическую трансплантацию костного мозга, поскольку она позволяет изолировать большое количество предшественников.

Для начала протокола пропитайте задние лапы и туловище заранее подготовленной мыши 75% этанолом, а изогнутыми тканевыми ножницами сделайте неглубокие надрезы на коже вокруг тазобедренного сустава. Затем снимите и обчистите задние лапы. С помощью щипцов сильно потяните кожу от бедра вниз к лодыжке, обнажая мышцу, и с помощью ножниц удалите кожный лоскут.

Разрежьте чуть выше бедренного и тазобедренного сустава и удалите всю заднюю ногу, разрезав кость. Работая в стерильном шкафу биобезопасности, перенесите ножки в одну из заранее подготовленных чашек Петри. С помощью ножниц разрежьте чуть ниже лодыжки и аккуратно удалите как можно больше мышц и эластичной соединительной ткани.

Очищенную кость переложите во вторую подготовленную чашку Петри. Далее отделите бедренную кость, колено и большеберцовую кость. С помощью щипцов держите ногу в колене и найдите костный мозг, слабую красную линию внутри костной полости в верхней части бедренной кости и ближе к концу большеберцовой кости.

Ножницами разрежьте большеберцовую кость чуть выше того места, где заканчивается костный мозг. Срежьте чуть ниже коленного сустава, срежьте чуть выше коленного сустава. Затем промойте костный мозг из бедренной и большеберцовой костей.

Наполните шприц объемом 10 миллилитров готовой средой из конической трубки объемом 50 миллилитров и закройте шприц иглой 23 калибра. Проведя кость щипцами над третьей подготовленной чашкой Петри, введите иглу в костный канал и протолкните через него среду, вымывая клетки. Повторяйте этот шаг до тех пор, пока сквозь кость не перестанет быть видно цвета.

Продолжайте процедуру, раздавливая эпифиз. Еще находясь во второй чашке Петри, крепко зажмите коленную чашечку щипцами, а кончиком шприца разомните колени. Продолжайте до тех пор, пока эпифизы не перестанут быть красными.

С помощью шприца перенесите клетки из второй и третьей чашек Петри в 50-миллилитровую трубку. Разбивайте комки, осторожно пипетируя вверх и вниз, и старайтесь избегать образования пузырьков. Центрифугируйте клетки.

Затем удалите надосадочную жидкость с помощью серологической пипетки, вытесните гранулу щелчком и лизируйте эритроциты, инкубируя их в одном миллилитре хлорида аммония калия или буфере для лизиса ACK, в течение одной минуты при комнатной температуре. С помощью серологической пипетки добавьте 40 миллилитров буфера HBSS. С помощью серологической пипетки отфильтруйте клетки через сетчатое фильтр 70 микрометров в новую коническую пробирку объемом 50 миллилитров и центрифугируйте клетки.

С помощью серологической пипетки удалите надосадочную жидкость и культивируйте клетки костного мозга в готовых средах с концентрацией 10 нанограмм на миллилитр рекомбинантного мышиного GM-CSF с плотностью от одного умноженного на 10-6-й клетки на миллилитр. С помощью серологической пипетки перенесите клетки в планшеты для культивирования тканей и инкубируйте их при температуре 37 градусов Цельсия в 5% углекислом газе, пока не сможете приступить к окрашиванию. Аккуратно, но тщательно проводите пипеткой по клеткам вверх и вниз, чтобы вытеснить слабо прилегающие клетки.

С помощью серологической пипетки перенесите клетки в коническую пробирку объемом 50 миллилитров и центрифугируйте клетки. Аккуратно слейте надосадочную жидкость и промойте гранулированные клетки, добавив 30 миллилитров промывочного буфера FACS (SFWB) с помощью серологической пипетки. Затем центрифугируйте ячейки и повторите промывку.

Затем суспензируйте и окрашивайте клетки в соответствии с инструкциями производителя антител. Ресуспендируйте пять раз по 10 до 7-х клеток в одном миллилитре FWB и добавьте по два микрограмма анти-Ly-6C и анти-CD115, меченных флуорофорами. Чтобы еще больше отличить CMP от MODC, добавьте два микрограмма антител против CD11C.

Инкубируйте образцы в течение 30 минут на льду. После инкубации с помощью серологической пипетки добавьте 10 миллилитров FWB и центрифугируйте клетки. Аккуратно слейте надосадочную жидкость, и промойте гранулированные клетки, добавив 30 миллилитров FWB с помощью серологической пипетки.

Центрифугируйте ячейки, и повторите промывку. Перед подвешиванием ячеек тщательно переверните трубку, чтобы выбить гранулу. С помощью серологической пипетки ресуспендируйте клетки в соотношении от 10 до 7-х клеток на миллилитр FWB и отфильтруйте их через клеточный фильтр с плотностью 35 микрометров.

С помощью серологической пипетки перенесите отфильтрованные клетки в полипропиленовую трубку и поместите пробирку на лед до тех пор, пока они не будут готовы к сортировке. Пропустите незагрязненный контроль через сортировщик клеток и примените затвор для удаления мелкого мусора и высокозернистых частиц. Пропустите одиночные флуоресцентные контрольные образцы через сортировщик клеток и при необходимости отрегулируйте компенсацию.

Запустите выборку из выборки с несколькими метками и наблюдайте за четырьмя различными популяциями. Примените затвор для изоляции каждой из четырех основных популяций. Подготовьте пробирки для сбора, добавив достаточное количество эмбриональной телячьей сыворотки (FCS), чтобы достичь конечной концентрации не менее 20% при заполнении.

Например, если вы используете пять миллилитровых туб, добавьте один миллилитр FCS перед сортировкой, и удалите трубку, когда она достигнет пяти миллилитров общего объема. Чтобы предотвратить обмен мембран и поглощение антител, храните все образцы при температуре четыре градуса Цельсия на протяжении всей сортировки. После того, как будет собрано желаемое количество клеток, используйте серологическую пипетку, чтобы перенести клетки в новую коническую трубку и центрифугировать клетки.

Осторожно удалите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клетки в 10 миллилитрах ДСБ, после чего снова центрифугируйте клетки. Повторите действие суспензии FWB в общей сложности два раза. Наконец, удалите надосадочную жидкость после второго промывания и действуйте, исходя из плана эксперимента.

Чтобы сохранить как можно больше каналов, доступных для анализа, жизнеспособные ячейки обычно выбирались на основе прямого и бокового рассеяния, исключая очень малые и очень детализированные события. Чтобы определить, надежно ли эта стратегия стробирования исключает мертвые клетки, образцы окрашивали 7-аминоактиномицином D. Клетки, проанализированные сразу после сбора, имели примерно 10% 7-AAD положительных клеток, когда типичный FSC, SSC gate был применен к свежевыделенным клеткам из костного мозга. Аналогичная доля мертвых клеток также присутствовала в пребывании 1 и пребывании 3 культивирования.

К пятому дню количество мертвых клеток внутри ворот было уменьшено до 5%, таким образом, использование таких ворот жизнеспособности обычно подходит для сортировки на пятый день и далее. Проточная цитометрия показала, что в популяции Ly6C-отрицательных, CD115-положительных, CD3, CD45R клеток сильно сохранялись в течение нулевого и третьего дней. На четвертый день осталось только несколько CD3, CD45R положительных клеток, а к пятому и шестому дню не было клеток, экспрессирующих CD3, CD45R; таким образом, в течение четырех дней культивирования в GM-CSF lineage положительные клетки практически отсутствовали и вообще не обнаруживались на пятый и шестой день культивирования.

При попытке выполнить эту процедуру важно помнить, что клеточный состав зависит от длины посева. Сортировка через три дня после сбора урожая дает большое количество ранних стадий и мало поздних стадий, и наоборот для культур, отсортированных через пять дней.