Электропроводящий эшафот чтобы модулировать и доставить стволовых клеток
13 апреля 2018 г.
Этот протокол описывает изготовление системы культуры клетки позволяют посева стволовых клеток на леске проводящего полимера в vitro электрической стимуляции и последующих в vivo имплантации с помощью стволовых клеток посеян эшафот Миниинвазивная техника.
Общей целью данной процедуры является создание платформы для проведения in vitro электростимуляции стволовых клеток на проводящем полимерном каркасе, с последующей имплантацией in vivo. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в исследованиях инсульта и биологии стволовых клеток, предоставляя средства для модуляции стволовых клеток. Основное преимущество заключается в том, что стволовые клетки могут быть оптимизированы in vitro, а затем имплантированы.
Хотя этот метод может дать представление о восстановлении после инсульта, он также может быть применен к другим системам в качестве нового метода доставки клеток. Как правило, новички в этой технике будут испытывать трудности из-за точности, необходимой для сборки клеточной камеры, и техники, связанной с краниэктомией. В процессе подготовки автоклавируют металлические пластины размером 2,5 на 12,5 см и проточные клапаны.
Далее, используя в качестве шаблона предметное стекло камеры, вырезаем два куска PDMS. Один кусок служит для очерчивания периметра камеры. На втором куске вырежьте две соседние части с внутренней стороны салазки патронника.
Обе части должны быть прямоугольными и совпадать с затвором патронника. Теперь наложите слои материалов. Начните с металлической пластины, затем неразрезанной PDMS, затем полипиррольной пластины, ориентированной перпендикулярно, затем PDMS с вырезами и, наконец, камеры клетки.
Тщательно выровняйте слои, и зажмите аппарат вместе. Затем отрежьте два отрезка металлической проволоки, чтобы она протянулась от аппарата к внешней стороне инкубатора, в котором он будет находиться. Длины 60 сантиметров обычно достаточно.
Затем с помощью серебряной пасты прикрепите проволоку к каждому концу полипиррольной пластины, выступающей снаружи камеры. Как только серебряная паста застынет, укрепите и загерметизируйте соединения с помощью эпоксидной смолы. Теперь запишите сопротивление по всей сборке с помощью мультиметра.
Применяемое поле должно быть одинаковым в каждой камере. Затем наденьте элементы на сборку и электрически стимулируйте их, как описано в текстовом протоколе. Перед имплантацией клеток извлеките провода из сборки.
Затем разжалуйте камеры ячеек и отделите PDMS от проводящего каркаса. Теперь каркас готов к имплантации. За сутки до операции дайте испытуемому животному ампициллин в питьевой воде.
В день операции сделайте крысу анестезиру изофлураном, а также подтвердите анестезию щипцом пальца ноги. Теперь нанесите искусственные слезы на глаза крысы, чтобы они оставались влажными. После бритья черепа накидывают животное на драпировку и подготавливают к стерильной операции.
Наденьте защитную одежду, распакуйте стерилизованные инструменты и простерилизуйте кожу головы. Для краниэктомии просверлите отверстие над левой корой головного мозга вплоть до твердой мозговой оболочки. Сделайте отверстие чуть больше, чем 1 на 3 миллиметра, размером с имплантат.
Затем откройте твердую мозговую оболочку и удалите твердую мозговую оболочку из головного мозга с помощью микротонкой хирургической иглы. Извлеките риг из инкубатора TC-culture и отключите риг. Далее аккуратно имплантируйте проводящий каркас из системы in vitro в кору головного мозга крысы.
Затем накройте имплантат Surgicel, чтобы зафиксировать его, иначе он может сместиться во время смыкания кожи. Теперь зашите рану с помощью шелкового шва 4-0. После наложения швов подкожно ввести крысам бупренорфин SR. Затем поместите крысу в клетку для восстановления, пока она не придет в сознание.
Послеоперационная процедура подробно описана в текстовом протоколе. Человеческие нервные клетки-предшественники подвергались электрической стимуляции, а затем окрашивались с помощью анализов жизнеспособности клеток. Зеленый цвет указывает на живую клетку.
Клетки явно были способны пережить электрическую стимуляцию. Факторы, высвобождаемые нейро-прогениторными клетками, которые важны для восстановления после инсульта, оценивались по одному микрограмму общей РНК с использованием количественного RTPCR. После нормализации результатов с помощью метода пороговых значений дельта-дельта-цикла они выявляют воздействие электростимуляции, повышающей экспрессию BDNF и THBS1.
Понаблюдав за этой процедурой, вы должны иметь хорошее представление о том, как создать систему клеточных культур для электропроводящих стволовых клеток и последующей имплантации этих стволовых клеток в модель крысы. После того, как процедура будет освоена, ее можно будет провести за 45 минут, если она будет выполнена правильно. Когда вы пытаетесь провести эту процедуру, важно помнить, что всегда нужно следить за правильным дыханием животных и цветом мембран, чтобы обеспечить надлежащую анестезию.
Не забывайте, что работа с крысами и стволовыми клетками может быть опасной, поэтому всегда следует соблюдать меры предосторожности, такие как ношение надлежащих СИЗ.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном протоколе описывается создание системы для культивирования клеток с целью посева стволовых клеток на проводящий полимерный каркас. Эта система позволяет проводить электрическую стимуляцию in vitro с последующей имплантацией in vivo с использованием малоинвазивного метода.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Биология стволовых клеток
- Методы электрической стимуляции
Теоретические сведения
- Метод направлен на оптимизацию стволовых клеток для исследований в области восстановления после инсульта.
- Он предлагает новый подход к модуляции поведения стволовых клеток.
- Точность имеет решающее значение для успешной сборки клеточной камеры.
- Для имплантации используется малоинвазивная техника краниэктомии.
Цель исследования
- Создание платформы для электрической стимуляции стволовых клеток in vitro.
- Облегчение имплантации оптимизированных стволовых клеток in vivo.
- Изучение возможностей применения в исследованиях инсульта и других систем.
Используемые методы
- Изготовление проводящего полимерного скаффолда.
- Посев стволовых клеток на скаффолд.
- Электрическая стимуляция стволовых клеток in vitro.
- Метод малоинвазивной имплантации.
Основные результаты
- Успешная оптимизация стволовых клеток для имплантации.
- Понимание механизмов модуляции поведения стволовых клеток.
- Потенциальные возможности применения при восстановлении после инсульта и методы доставки клеток.
- Выявленные трудности для новых пользователей, касающиеся точности и техники выполнения.
Выводы
- Данный метод представляет собой ценный инструмент для исследования стволовых клеток.
- Он расширяет понимание механизмов восстановления после инсульта.
- Дальнейшие исследования могут привести к достижениям в области клеточной терапии.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для промышленности
Электропроводящие скаффолды для доставки стволовых клеток представляют собой инновационную платформу для модуляции фенотипа клеток перед трансплантацией, что позволяет решить одну из ключевых проблем регенеративной медицины и моделирования неврологических заболеваний. Данный подход обеспечивает оптимизацию свойств стволовых клеток in vitro, что повышает прогностическую достоверность последующих исследований in vivo и способствует снижению рисков при переходе к этапам доклинических испытаний. Модульность этого метода делает его универсальным инструментом для различных приложений в области клеточной терапии и тканевой инженерии.
Стратегические области применения в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранние этапы поиска и валидация мишени
- Позволяет исследовать реакцию стволовых клеток на электрические стимулы, что проясняет механистические пути, имеющие значение для выживания клеток и нейрорегенерации.
- Способствует снижению биологических рисков, обеспечивая возможность модуляции и оценки экспрессии генов, связанных с терапевтическими результатами, перед имплантацией.
- Облегчает функциональную валидацию мишеней путем сопоставления предварительной подготовки in vitro с эффективностью in vivo в моделях заболеваний.
Скрининг и разработка анализа
- Позволяет подготавливать стандартизированные популяции стволовых клеток с предварительной электрической стимуляцией для обеспечения воспроизводимости последующих анализов.
- Обеспечивает количественную оценку экспрессии генов и жизнеспособности клеток после стимуляции, что способствует разработке методов анализа.
- Предоставляет платформу для масштабируемой оценки параметров скаффолдов и стимуляции для различных типов клеток.
Трансляционные и доклинические исследования
- Сопоставляет модуляцию клеток in vitro с соответствующими моделями заболеваний in vivo, что способствует поиску трансляционных биомаркеров.
- Обеспечивает преемственность от этапа оптимизации клеток на стадии поиска до доклинической валидации в моделях неврологических повреждений.
- Поддерживает принятие решений с учетом рисков путем установления связи между эффектами прекондиционирования и функциональными результатами после имплантации.
Интеграция конвейера и рабочего процесса
Данный метод интегрируется в континуум от этапа поиска до доклинических исследований, обеспечивая модуляцию стволовых клеток in vitro с последующим тестированием in vivo на моделях заболеваний, таких как инсульт. Он позволяет проводить итеративную оптимизацию и сравнительный анализ различных экспериментальных условий.
- Открывающая биология: предоставляет платформу для проверки гипотез о влиянии электрической стимуляции на фенотип стволовых клеток и экспрессию генов.
- Скрининг: обеспечивает получение воспроизводимых, предварительно кондиционированных популяций клеток для последующих функциональных анализов.
- Аналитика: позволяет количественно измерить экспрессию генов и жизнеспособность, что способствует принятию решений на основе данных.
- Трансляционные исследования: связывает оптимизацию in vitro с исследованиями эффективности in vivo на соответствующих моделях животных.
- Корпоративное повторное использование: предлагает модульный рабочий процесс, адаптируемый к различным типам клеток и терапевтическим контекстам.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает достоверность прогнозирования результатов клеточной терапии за счет возможности модуляции и оценки клеток перед имплантацией.
- Операционная ценность: Стандартизирует протоколы подготовки и стимуляции клеток, что повышает воспроизводимость и масштабируемость.
- Стратегическая ценность: Повышает качество принятия решений о целесообразности дальнейшей разработки (go/no-go) путем установления связи между оптимизацией in vitro и эффективностью in vivo.
- Влияние на портфель: Обеспечивает приоритизацию кандидатов для клеточной терапии и способов их доставки с учетом рисков.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы с культурами клеток, электрической стимуляцией и хирургией на мелких животных.
- Необходима точная сборка многослойных клеточных камер и проводящих каркасов.
- Требуется валидированное оборудование для электрической стимуляции и количественного анализа экспрессии генов.
- Для обеспечения воспроизводимости результатов в разных экспериментах и центрах необходима межкомандная стандартизация.
- Адаптация метода для других типов клеток или моделей заболеваний может потребовать оптимизации и валидации протокола.
