Высокая пропускная способность SiRNA скрининга для хлорпикрина и фтористый водород индуцированной роговицы травм эпителиальных клеток

В этом видео показаны наши методы высокопроизводительного скрининга миРНК на модели повреждения токсикантами эпителиальных клеток роговицы. Эта работа важна, потому что высокопроизводительный скрининг миРНК является экономически эффективным и эффективным по времени методом выяснения путей и регуляторов клеточного ответа на токсиканты. Эта работа может помочь нам лучше понять, как роговица реагирует на токсикантные воздействия.

Приготовьте суспензию эпителиальных клеток роговицы в предварительно подогретой среде, содержащей 0,5 мкг на миллилитр гидрокортизона в одноразовом флаконе со средой. Покрутите флакон, чтобы равномерно подвешивать клетки, и вылейте в резервуар на орбитальном встряхивающем гнезде автоматизированного обработчика жидкостей. Держите суспензию ячеек на нагревательной пластине при температуре 37 градусов во время процесса нанесения покрытия ячеек.

Используйте автоматизированный манипулятор жидкостей для добавления ячеек в планшеты с плотностью одна тысяча клеток на лунку в 70 микролитрах среды на лунку на 96-луночном планшете. Засейте не менее 14 96-луночных планшетов клетками для каждой исследуемой библиотечной пластины миРНК. Постоянно запускайте орбитальный шейкер со скоростью 100 циклов в минуту во время процесса посева и используйте скорость пипетирования 50 микролитров в секунду для всех этапов.

Смешайте суспензию ячеек с помощью автоматического обработчика жидкости перед посевом первой пластины. Отсадите 140 микролитров клеточной суспензии и распределите по 70 микролитров в каждую лунку двух планшетов для клеточных культур. Повторяйте перемешивание и дозирование до тех пор, пока все планшеты не будут засеяны ячейками.

При необходимости заполняйте резервуар для суспензии элемента. После того, как пластины были засеяны, извлеките их из жидкостного погрузчика и инкубируйте в течение 30 минут при комнатной температуре. Затем перенесите их в инкубатор для клеточных культур.

Оцените плотность клеток всех планшетов на следующее утро с помощью автоматизированной системы визуализации, которая размещена в инкубаторе для клеточных культур. Исключите из исследования пластины, внутренние колодцы которых не сливаются на 15-22 процента. Трансфектируют клетки через 24 часа после посева четырьмя пикомолами на лунку миРНК и 0,3 мкл на лунку реагента для трансфекции следующим образом.

Приобретите у поставщика библиотечные планшеты миРНК, сконфигурированные таким образом, чтобы они содержали 80 мишеней мишеней мимишеней миРНК на каждой пластине с первым и двенадцатым столбцами, оставленными пустыми. Восстановите библиотечную пластину миРНК с буфером миРНК в соответствии с инструкциями производителя до конечной концентрации двух пикомолев на микролитр для каждой лунки миРНК. Выполняйте все трансфекции с помощью автоматизированного манипулятора для обработки жидкостей и скорости пипетирования 25 микролитров в секунду для всех этапов.

Используйте предварительно настроенные коробки для наконечников, чтобы обращаться только к скважинам, которые будут трансфицированы. Используйте верхнюю половину библиотечной пластины для трансфекции набора из шести реплик пластин, называемого набором верхней пластины"Используйте нижнюю половину библиотечной пластины для трансфекции другого набора из шести реплик пластин, называемого набором нижних пластин"Вместе двенадцать пластин составляют полный набор пластин, И каждая клеточная пластина содержит один и тот же набор элементов управления. Трансфицируйте лунки от B2 до B6 всех планшетов с отрицательным пулом миРНК после того, как все верхние и нижние наборы планшетов были трансфицированы библиотечными миРНК.

Также трансфектировать лунки В2 в В6 еще двух планшетов, которые не получают библиотечные миРНК с отрицательным пулом миРНК. Они будут служить в качестве неоткрытых элементов управления. Инкубируйте все клеточные планшеты в инкубаторе для клеточных культур в течение четырех часов после добавления трансфекционных смесей и перемешивайте легкими постукиваниями каждый час.

Используйте автоматический манипулятор для обработки жидкостей для двукратной промывки пластин предварительно подогретой средой, разведенной от одного до пяти в PBS и повторно поданной 100 микролитров на лунку предварительно подогретой среды. Используйте скорость пипетирования 50 микролитров в секунду для всех этапов. Используйте лунки от C2 до C6 в качестве нетрансфицированных контрольных отверстий.

Следите за тем, чтобы лунки от B7 до B11 и от C7 до C11 не подвергались переработке, чтобы использовать их в качестве средств контроля воздействия токсичных веществ. Через 24 часа после перефикации используйте автоматизированный манипулятор для повторной подачи тарелок. Используйте скорость пипетирования 50 микролитров в секунду для всех этапов.

Отасуньте 100 микролитров из каждой скважины и слейте их в резервуар для отходов. Повторно подкормите каждую лунку по 100 микролитров на лунку предварительно подогретым H-Cort.medium. При необходимости опорожните резервуар для отходов.

При необходимости наполняйте резервуар средой. Через два дня после трансфекции и за два часа до воздействия приготовьте 62,5 микромольный раствор положительного контроля кардамонина в H-Cort. среднюю, и добавить в ряд В 8-рядного резервуара для разбавления.

Приготовьте 06,25-процентный раствор ДМСО в H-Cort. meduim, и добавьте в ряд С того же резервуара. ДМСО используется в качестве системы управления транспортным средством.

С помощью автоматизированного обработчика жидкости удалите 10 микролитров среды из скважин от B7 до B11 и от C7 до C11 каждой клеточной пластины и сбросьте ее в ряды G и H резервуара. Обязательно используйте предварительно настроенные коробки для наконечников, чтобы обращаться только к тем лункам, которые будут получать положительный сигнал и контроль транспортного средства, и используйте скорость пипетирования 50 микролитров в секунду для всех этапов. Перенесите в эти лунки 10 микролитров положительного и автомобильного регуляторов и перемешайте три раза.

Верните эти клеточные пластины в инкубатор. Повторите эти действия для всех дополнительных клеточных пластин. Выполняйте все операции по химическому воздействию в вытяжном шкафу для химических веществ, надев двойные нитриловые перчатки, лабораторный халат, одноразовые полиэтиленовые протекторы для рукавов и защитные очки.

Обеззараживайте наконечники пипеток и резервуары, которые контактировали с фтористоводородной кислотой, и любой жидкой фтористоводородной кислотой с 2,5-процентным содержанием глюконата кальция перед утилизацией в потоке опасных отходов. Для каждой исследуемой библиотечной пластины приготовьте 0,0036-процентный раствор фтористоводородной кислоты, добавив 288 микролитров однопроцентной фтористоводородной кислоты к 80 миллилитрам предварительно подогретого H-Cort. средний в бутылке объемом 150 миллилитров.

Переверните бутылку и инкубируйте разбавленную плавиковую кислоту в инкубаторе с температурой 37 градусов в вытяжном шкафу для химикатов в течение десяти минут. Добавьте раствор фтористоводородной кислоты в резервуар с реагентом на пластинчатом грелке. Выполняйте экспозицию с помощью двух техников, работающих в тандеме.

Попросите лаборанта справа удалить среду для культивирования клеток с клеточной пластины с помощью двенадцатиканального пипеттера, а затем передать планшет лаборанту слева. Попросите техника слева добавить 100 микролитров в лунку раствора среды плавиковой кислоты. Повторите этот процесс для всех клеточных пластин, которые будут подвергаться воздействию токсиканта.

Кроме того, повторите этот процесс для неэкспонированных контрольных пластин, используя свежую среду вместо раствора фтористоводородной кислоты. Поместите пластины в химический вытяжной шкаф на 20 минут, а затем верните их в инкубатор для клеточных культур. Повторите этап добавления положительного контроля, как показано ранее, после того как все планшеты будут подвергнуты воздействию и возвращены в инкубатор для клеточных культур.

Соберите надосадочную жидкость клеточной культуры и оцените жизнеспособность клеток с помощью анализа МТТ через 24 часа после воздействия. Приготовьте раствор из 0,5 миллиграмм на миллилитр субстрата МТТ в PBS, содержащем 10 грамм на литр глюкозы, и подогрейте до 37 градусов. Добавьте субстрат MTT в резервуар на автоматизированном манипуляторе для обработки жидкостей.

Используйте скорость пипетирования 50 микролитров в секунду для всех этапов. Предварительно настройте подсказочные ящики только для тех скважин, которые необходимо исследовать. С помощью автоматизированного манипулятора жидкости можно отсасывать 95 микролитров среды из внутренних 60 лунок клеточной пластины и закачивать по 42,5 микролитра в каждую из двух 384-луночных накопительных пластин.

Немедленно добавьте 100 микролитров на лунку раствора субстрата МТТ в клеточные планшеты, и инкубируйте их при температуре 37 градусов в инкубаторе для клеточных культур в течение одного часа. Запечатайте пластины для хранения на 384 лунки и храните их при температуре минус 80 для последующего анализа. Повторите этот процесс для всех наборов верхних и нижних пластин и связанных с ними неэкспонированных элементов управления.

При необходимости заполните резервуар для субстрата MTT. При желании используйте наконечники между репликами, но мойте их при добавлении раствора подложки MTT и при переключении между наборами пластин. После одночасовой инкубации используйте автоматический манипулятор для удаления субстрата MTT из внутренних 60 лунок каждой клеточной культуральной пластины и замените его на 100 микролитров на лунку ДМСО.

Используйте скорость пипетирования 50 микролитров в секунду для всех этапов и предварительно настройте коробки наконечников только для тех лунок, которые необходимо исследовать. Опорожните резервуар для отходов и при необходимости наполните резервуар ДМСО. Встряхивайте тарелки на шейкере в течение трех минут.

Измерьте поглощение на 570 и 690 нанометрах с помощью пластинчатого спектрофотометра. Вычтите фоновое поглощение на 690 нанометрах из поглощения на 570 нанометрах и усредните значения для каждой контрольной группы на неэкспонированной пластине. Рассчитайте процент жизнеспособности, разделив значения поглощения для каждой цели на среднее значение поглощения неэкспонированных элементов управления.

Используйте средний пул неэкспонированных отрицательных клеток для вычисления процента жизнеспособности клеток для всех целей. Измерьте концентрацию IL-8 в надосадочной жидкости клеточных культур с помощью анализа на основе гранул без промывки, в соответствии с инструкциями производителя. Создайте схему пробирной пластины для размещения образцов и стандартов.

Выньте пластины для хранения на 384 лунки из морозильной камеры минус 80 и разморозьте при комнатной температуре. Кратковременно центрифугируйте планшеты, чтобы собрать пробу на дне лунок. Добавьте акцепторные шарики против IL-8 и биотинилированные антитела в черную 384-луночную пластину для хранения.

Добавьте смесь шариков и антител в лунки, предназначенные для использования для образцов и стандартной кривой, в соответствии со схемой пробирной пластины. Восстановите стандарт в среде, содержащей 354 микромоляра натрия хлорида. Сделайте двукратное последовательное разведение стандартной кривой и добавьте в три раза в другую черную 384-луночную накопительную пластину.

Для проведения анализа используйте автоматизированный манипулятор для обработки жидкостей. Используйте предварительно настроенные оtip-боксы для обработки лунок в соответствии с раскладкой пробирной пластины. Используйте скорость пипетирования 50 микролитров в секунду для всех этапов.

Переложите 8 микролитров смеси акцепторных шариков и антител в белые 384-луночные пластины для анализа неглубоких лунок. Добавьте смесь шариков и антител в лунки, предназначенные для использования для образцов и стандартной кривой в соответствии со схемой пробирной пластины. Затем перенесите стандартную кривую в соответствующие лунки на пластинах для анализа неглубоких лунок.

Далее приготовьте 3,54 молярного раствора хлорида натрия в неглубоком водоеме. Отрегулируйте концентрацию соли в образцах в соответствии со стандартной кривой, перенеся 4,5 микролитра раствора хлорида натрия в образцы в черных 384-луночных планшетах для хранения. Перемешайте образцы три раза, используя объем смеси 30 микролитров, а затем перенесите два микролитра образцов в белые пластины для неглубоких лунок в соответствии со схемой пробирной пластины.

Выдерживать в течение одного часа в темноте при комнатной температуре. Добавьте вторичные шарики в черную 384-луночную пластину для хранения. Добавьте бусины в лунки, предназначенные для использования для образцов и стандартной кривой в соответствии со схемой пробирной пластины.

Переложите 10 микролитров вторичных шариков в лунки белой 384-луночной неглубокой пробирной пластины, на которые будет получена стандартная кривая или образцы в соответствии с раскладкой пробирной пластины. Промойте кончики между каждой пластиной. Выдержать еще час в темноте при комнатной температуре.

Запечатайте пробирные пластины прозрачными пломбами и отсканируйте с помощью считывателя пластин, совместимого с анализом на основе шариков. Используйте расстояние между пластиной и детектором 0,2 миллиметра, время возбуждения 180 миллисекунд для сканирования и время измерения 550 миллисекунд. Импортируйте исходные данные из анализов IL-8 в таблицу.

Используйте автоматическую аппроксимацию кривой для стандартной кривой анализов IL-8, а затем преобразуйте исходные данные в пикограммы на миллилитр для каждого образца. Вычислите среднее значение шести реплик для каждого целевого объекта. Затем рассчитайте значения SSMD и сверните изменение относительно открытых отрицательных элементов управления.

Отобразите данные в виде графика с двойным фонариком, который показывает изменение складки по оси x и SSMD по оси y для каждой цели. В заключение мы разработали методы и условия культивирования, подходящие для высокопроизводительного скринингового исследования повреждения глаз токсикантами. Мы доказали полезность этих методов, завершив первичный скрининг библиотеки миРНК в модели повреждения фтористоводородной кислотой.

Высокопроизводительные наборы геномных данных могут внести значительный вклад в понимание роли, которую определенные гены играют в травме или заболевании, что может помочь более эффективно сосредоточить последующие исследования in vitro или in vivo.