Высокая чувствительность обнаружения микрометастазы, порожденных GFP человека преобразованы Organoids культивированный от опухоли пациента производные Колон

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области биологии опухолей о микрометастазах, обнаруженных у пациентов с раком толстой кишки. Основное преимущество этого метода заключается в том, что он позволяет обнаруживать у мышей высокочувствительные микрометастазы, индуцированные мечеными GFP органоидами рака толстой кишки, полученными от пациентов. Как правило, люди, плохо знакомые с этим методом, испытывают трудности, потому что может быть трудно обнаружить микрометастазы, полученные из органоидов опухоли толстой кишки, в отдаленных органах у мышей.

Демонстрировать процедуру вместе с Ю Окадзавой будут Косуке Мидзукоси и Ю Кояма, оба аспиранты и хирурги из моей группы. Чтобы получить органоиды клеток колоректального рака человека, сначала добавьте 150 микролитров искусственного внеклеточного матрикса на лунку в 12-луночный планшет со льдом. Когда все лунки будут покрыты, инкубируйте планшет в течение 30–60 минут в инкубаторе с температурой 37 градусов Цельсия и 5% CO2 для затвердевания гелей.

Затем ресуспендируйте гранулу опухолевого ксенотрансплантата, полученную от пациента, в свежую культуральную среду для культуры органоидов колоректального рака с добавлением 5% эмбриональной сыворотки теленка, или СКС, для достижения концентрации от трех до 10-пяти клеток на миллилитр, и засейте один миллилитр клеток в каждый искусственный внеклеточный матрикс. Затем верните клетки в инкубатор для клеточных культур. На следующее утро осторожно перенесите надосадочную жидкость культуры, включая плавающие клетки, в 1,5-миллилитровые микроцентрифужные пробирки для их центрифугирования и ресуспендируйте гранулы в 70 микролитрах свежего искусственного внеклеточного матрикса на льду.

Чтобы повысить жизнеспособность клеток колоректального рака, наложите плавающую опухолевую клетку, содержащую искусственный внеклеточный матрикс, обратно на лунки, покрытые искусственным внеклеточным матриксом, и инкубируйте культуры опухолевых клеток в течение 30 минут в инкубаторе для клеточных культур. Когда новый гель внеклеточного матрикса затвердеет, скармливайте культурам один миллилитр свежей среды для культуры органоидных клеток колоректального рака с добавлением 1% FCS и верните клетки в инкубатор для клеточных культур. После 7-10 дней культивирования органоиды отделите механическим способом с помощью стерильного скребка для клеток и переложите органоиды в 1,5-миллилитровые микроцентрифужные пробирки для их центрифугирования.

Затем повторно суспендируйте гранулы в 500 микролитрах PBS с легким постукиванием для еще одного центрифугирования. Чтобы диссоциировать органоиды колоректального рака, добавьте в пробирки 500 микролитров раствора протеолитического и коллагенолитического фермента и перемешайте, слегка постукивая. Через 10 минут при комнатной температуре добавьте в клетки 500 микролитров среды с добавлением 1% FBS, и очень аккуратно несколько раз пипетируйте клеточную суспензию для расщепления органоидов.

Бережное пипетирование органоидов CRC человека во время обработки имеет решающее значение для поддержания неповрежденного сфероидного образования в культуре. Снова центрифугируйте клетки и повторно суспендируйте гранулы в 100 микролитрах 5-кратного запаса лентивируса GFP и 400 микролитров свежей питательной среды для органоидов колоректального рака. Важно инфицировать органоиды CRC человека высоким титром лентивируса GFP, особенно для достижения почти 100% инфекции CRC.

Отрегулируйте объем в каждой пробирке так, чтобы получить от пяти до пяти диссоциированных опухолевых клеток на 500 микролитров средней концентрации, и поместите 500 микролитров клеток в каждую лунку 12-луночного планшета, покрытого искусственным внеклеточным матриксом, как показано на рисунке. После 18 часов в инкубаторе для клеточных культур переложите плавающие, содержащие клетки надосадочную жидкость в отдельные микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл для центрифугирования с последующей ресуспензией гранул в 70 мкл искусственного внеклеточного матрикса на пробирку на лед. Чтобы повысить жизнеспособность клеток колоректального рака, наложите содержащий опухолевую клетку искусственный внеклеточный матрикс на опухолевые органоиды в 12-луночном планшете и поместите планшет в инкубатор для клеточных культур на 30 минут.

Когда покрытие искусственного внеклеточного матрикса застынет, скармливают культурам один миллилитр свежей органоидной питательной среды CRC с добавлением 1% FCS и возвращают клетки в инкубатор для клеточных культур на трое суток. Затем наблюдайте за инфицированными клетками с помощью флуоресцентной микроскопии, чтобы подтвердить почти 100% положительный результат GFP, и верните клетки в инкубатор еще на четыре-шесть дней. Чтобы создать мышиную модель спонтанного метастазирования опухолевых ксенотрансплантатов, полученных от пациентов с КРР, диссоциируйте меченые GFP органоиды, как показано, и разбавьте суспензии одиночных опухолевых клеток в соотношении от пяти до пяти опухолевых клеток на 50 микролитров PBS с добавлением 50% концентрации искусственного внеклеточного матрикса.

Загрузите 50 микролитров клеток каждой мыши в шприц, оснащенный иглой 22-го калибра, и поместите опухолевые клетки на лед. Затем подтвердите отсутствие реакции на защемление пальца ноги и поместите первую мышь под наркозом NOG в положение лежа на лабораторном столе. С помощью стерильного пинцета аккуратно вытяните слизистую оболочку прямой кишки из анального отверстия, и сразу же введите опухолевые клетки в подслизистую оболочку прямой кишки.

Чтобы создать экспериментальную модель метастазирования опухолевых ксенотрансплантатов от пациентов с КРР, разбавьте суспензию одиночных опухолевых клеток в соотношении от четырех до четырех клеток в концентрации 50 микролитров и загрузите 50 микролитров клеток на мышь в шприц, оснащенный иглой 22 калибра. Первую мышь под наркозом поместите в положение лежа на скамейке, а в нижней области левого бока сделайте небольшой надрез. С помощью стерильных ножниц и пинцета аккуратно разрежьте брюшину и обнажите селезенку, а пинцетом захватите жир, прикрепленный к селезенке.

Затем медленно введите 50 микролитров суспензии опухолевых клеток в селезенку, следя за тем, чтобы не наблюдалось утечки. После того, как все мыши были введены и зашиты по мере необходимости, верните животных в их домашние клетки и проверьте наличие швов и жизнеспособность через день после доставки опухолевых клеток. Используйте штангенциркуль для еженедельного измерения опухолей, собирая первичные опухоли и соответствующие ткани до соответствующих экспериментальных конечных точек.

Перенесите препарированные опухоли и органы в пять миллилитров ледяного PBS в 10-сантиметровую чашку Петри на льду и наблюдайте за рассеченными тканями под стереофлуоресцентным микроскопом, чтобы оценить их экспрессию GFP. Заражение органоидов CRC лентивирусом GFP, как показано, приводит к тому, что почти все органоиды экспрессируют очень яркую GFP. Ортотопическое и интраспленочное введение меченых GFP органоидов вторичным реципиентным мышам NOG выявляет формирование GFP-положительных первичных опухолей в ортотопическом участке, а также в легких большинства обследованных мышей через 2,5 месяца после инъекции.

Кроме того, метастазы в печени наблюдаются у животных-реципиентов NOG через месяц после интраспленочного введения. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как обнаруживать микрометастазы меченых GFP органоидов клеток колоректального рака человека после их введения мышам-реципиентам. При проведении этой процедуры важно помнить, что эффективность хоуминга опухолей и метастазов органоидов клеток рака толстой кишки человека у мышей в значительной степени зависит от межпациентской вариабельности исходных опухолевых клеток.